發狀根在大豆基因工程中應用的研究進展

于威君+李曉薇+肖洪慶+Aysha+Jameel+侯心悅+李海燕

摘 要：發狀根農桿菌Ri質粒侵染植物后誘導大量發狀根發生，由此發展起來的遺傳轉化體系已經成為一項非常重要的轉基因技術，并被應用到生命科學的多個領域。大豆是重要的糧食作物和油料作物，也是目前轉基因種植面積最大的作物。現有的大豆子葉節、幼胚、胚尖遺傳轉化體系轉化效率低、周期長，而發狀根遺傳轉化體系具有轉化效率高、周期短等優點，因此發狀根在大豆基因工程研究中被廣泛應用。本文綜述了近年來發狀根在大豆基因工程中的應用研究進展。

關鍵詞：發狀根；大豆；基因工程；分子育種

中圖分類號：Q-1 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170206001

大豆在我國與稻谷、玉米和小麥共同構成了四大糧食作物，同時大豆在農業生產和食物消費系統中占有重要的地位和作用[1]。近年，全球轉基因大豆的種植面積已是轉基因品種種植面積最大的作物。可見，轉基因技術已成為大豆新品種培育的重要手段。目前應用的大豆遺傳轉化技術主要是以子葉節、幼胚、胚尖作為外植體，轉化后誘導大豆再生植株。但是，這些方法周期較長且轉化效率低，不利于快速鑒定相關基因在大豆育種中的應用潛力。發狀根農桿菌介導的大豆遺傳轉化體系，因其周期短、轉化效率高且不易產生變異等優點，越來越受到重視。本文就發狀根轉化體系在大豆基因工程中的應用研究做一綜述，展望該項技術的應用前景，為大豆育種工作者們提供一些有用信息。

1 發狀根遺傳轉化體系概述

發狀根農桿菌中含有Ri質粒，與根癌農桿菌中的Ti質粒類似，上面含有T-DNA區，侵染植物后，T-DNA區能夠轉移并整合進植物的基因組中。發狀根農桿菌轉化侵染植物后，在侵染部位或四周產生大量的發狀根，而且所產生的發狀根能夠合成該植物特征的次生代謝產物，因此發狀根可作為植物次生代謝產物的生物反應器。另外，通過單細胞分化而來的發狀根變異性低，能夠穩定遺傳，且更容易獲得再生的轉化植株，因此該項技術自產生以來迅速被應用到基因功能的研究和品種改良等。據統計有200多種植物[2]可被誘導出發狀根，大多集中在茄科、菊科、十字花科、旋花科、傘形科、豆科、石竹科和蓼科等草本植物中，而木本植物較少有成功轉化的報道[3]。這就意味著，發狀根遺傳轉化技術在植物界，尤其是在草本植物中，具有廣闊的應用前景。

發狀根誘導培養過程并不復雜。發狀根農桿菌侵染植物組織創傷部位（葉片、莖段、葉柄、根切片等）和發狀根農桿菌共培養，其Ri 質粒中的T-DNA區轉移并整合到植物基因組上。經過一段時間培養，植物組織的創傷部位誘導產生發狀根。接下來按一定長度剪下發狀根，轉移到固體培養基上繼代培養多次，以消除共培養殘留的農桿菌。把每個發狀根系轉移到液體培養基中培養，或者進一步誘導再生出轉化植株。通常認為創傷組織上，每個萌發的發狀根代表一個發狀根系[4]。

2 發狀根在大豆基因工程中的應用

2.1 大豆發狀根用于啟動子的功能研究

大豆發狀根轉化體系具有周期短、轉化效率髙、單細胞分化的發狀根變異性低等優點。通過啟動子在大豆發狀根中可以快速表達的特性，揭示其在大豆自身中的表達活性。植物啟動子的研究有助于了解基因轉錄調控表達模式及其調控機制，并應用于基因工程中提高或改進外源目的基因的表達。而根特異表達基因的獲得，是進一步研究其啟動子如何進行基因組織特異表達的基礎。現有報道，通過抗大豆孢囊線蟲（SCN）誘導合成啟動子，驅動綠色熒光蛋白基因（GFP）在發狀根中表達，驗證了該合成啟動子是誘導型啟動子[5]。通過大豆水通道蛋白基因（GmTIPp）啟動子及其缺失片段的啟動子調控報告基因（GUS）在發狀根中表達，進一步了解GmTIPp啟動子的特異核心序列區域 [6]。發現在發狀根中接種根瘤后，大豆胞外復合物（GmExo70J7、GmExo70J9）啟動子的活性受到顯著的抑制[7]。大豆硫轉運蛋白基因（GmSULTR）啟動子截取部分片段序列作為啟動子，具有驅動下游GUS基因在發狀根中表達的功能，而且在根毛、根表皮和中柱內表達且啟動活性比CaMV35S啟動子的啟動活性弱[8]。在大豆發狀根中比較玄參花葉病毒（FMV）啟動子，木薯葉脈花葉病毒（CsVMV）啟動子，草莓鑲脈病毒（SVBV2）啟動子，35S和E35S啟動子驅動GUS基因的表達活性，證明FMV啟動子在根中是強表達[9]。在大豆發狀根中驗證大豆疫霉誘導性基因（GmaPPO12、 GmaPR1）啟動子功能，可用于轉基因植物，增強對疫霉病病原體的抗性[10]。在大豆發狀根中通過GUS活性測定，得到改造的乙醇脫氫酶基因（Adh）啟動子可由缺氧誘導，但低溫，創傷或ABA不能誘導。得到的Adh啟動子可用于轉基因實驗中缺氧誘導的表達，以改善植物對水淹或缺氧脅迫的耐受性[11]。在大豆發狀根利用光響應性驗證了甲基轉移酶（rbcMT-T）啟動子片段對報告基因的表達能力[12]。克隆的大豆脯氨酸富集蛋白基因（GmPRP2）啟動子，其表達模式表明該啟動子在大豆的發狀根中是根優先的。可用于提高對病原體，害蟲，營養不良和其他非生物脅迫的根抗性或耐受性，減少大豆生產中的大量年產量損失[13]。

2.2 大豆發狀根用于研究調控基因

大豆發狀根多用于功能基因的分析尤其是抗性基因的檢驗，其中抗性中以旱生、耐鹽堿研究為主。在發狀根中氫離子焦磷酸酶類基因（GmVP）過表達能提高鹽脅迫下發狀根的相對伸長率，提高發狀根的耐鹽性，并能提高SOD、POD、CAT活性和減低MDA含量[14]。通過對轉Na+/H+逆向轉運蛋白基因（GmNHX1）、Cl-/H+逆向轉運蛋白基因（GmCLC1）、紫色酸性磷酸酶基因（GmPAP3）發狀根的功能分析，表明其能夠顯著提高轉基因發狀根的耐鹽性[15]。在發狀根中，RNA沉默的大豆MYB轉錄因子基因（GmMYB176）導致異黃酮水平降低，顯示GmMYB176是異黃酮類生物合成所必需的[16]。對轉大豆20ZF轉錄因子基因Gm20ZF-1-RNAi基因的發狀根進行異黃酮含量檢測，發狀根中異黃酮含量顯著下降，表明Gm20ZF-1與大豆異黃酮的積累有關[17]。大豆膨脹素基因（GmEXPB2）參與發狀根伸長，而影響植物生長和磷吸收，特別是在低磷水平。這一發現在改善農業作物的生長上具有很大的應用潛力[18]。

2.3 大豆發狀根用于其他研究

利用大豆發狀根表達蛋白可以更加簡易，量產。通過大豆發狀根成功生產表達人堿性成纖維生長因子（bFGF），研究證明發狀根能夠通過無性繁殖穩定遺傳，轉基因大豆發狀根可作為生物反應器制備，也是安全的，同時為利用發狀根生產藥物實現工業化提供實驗基礎[19]。CRISPR/Cas9介導的基因組修飾的每個靶基因座的效率可以利用其在發狀根中的表達進行快速地評估[20]。通過用大豆查耳酮合酶（CHS6）或異黃酮合成酶（IFS2）基因轉化，在發狀根中改變異黃酮的合成而影響植物抗毒素的合成，得到植物抗毒素在植物中對真菌感染反應中的重要作用的新證據[21]。大豆胞囊線蟲轉化大豆發狀根可以完成其整個生命周期表達GFP。該系統可以測試基因是否抗大豆胞囊線蟲病，得到抗病植株[22]。

3 展望

全球氣候變化加劇，我國嚴寒、高溫、干旱、洪澇災害頻發，同時自然災害會引發一系列病蟲災害，生物脅迫與非生物脅迫共同威脅著大豆的產量與品質。目前正通過遺傳學、分子生物學等微觀層面研究大豆相關脅迫機制，并鑒定重要基因的功能，利用生物技術，生物工程手段等提高大豆的抗病抗逆性及品質，得到優良的大豆品系。發狀根的發展歷史雖短，但是已經深入基礎研究，目前可用于培養物生產有用的活性物質，作為研究根系相關基因的驗證系統，為改善大豆根的特性提供依據，如能通過組織培養大豆發狀根獲得再生植株，則開辟了大豆高效遺傳轉化的新途徑，提高了大豆轉化效率，為大豆育種提供新的方法，同時可以用于快速鑒定大豆相關的基因功能。大豆發狀根正在廣泛應用于大豆品種的改良研究，為改良大豆提供依據，獲得長勢更好，產量更高，抗逆性更強的新植株提供實驗基礎。但是開展大豆轉基因品種選育和基因功能研究仍有許多限制因素需要解決。

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