多粘類芽孢桿菌DN—1固態發酵條件優化

胡飛 蘇衛華 胡本進 周子燕 徐麗娜 陳浩梁 蘇賢巖

摘要[目的]探討多粘類芽孢桿菌DN-1固體發酵條件。[方法]以活菌數和芽孢率為指標，采用單因素和多因素試驗對DN-1菌株的最適培養基成分及發酵條件進行優化。[結果]菌株DN-1最適培養基配比為：15%稻殼，40%玉米粉，20%馬鈴薯，10%茶渣餅，15%水，0.1%磷酸氫二鉀和0.2%硫酸錳。最適發酵條件為：發酵時間72 h，發酵溫度37 ℃，初始pH 6.5～7.0，接種量10%。優化后菌株DN-1活菌數、芽孢率分別達26.3億/g、92%。[結論]試驗結果為DN-1菌株的進一步研究及應用提供了參考。

關鍵詞多粘類芽孢桿菌DN-1；活菌數；芽孢率；發酵；優化

中圖分類號S476文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）09-0151-04

Optimizing Solid Fermentation Condition for Paenibacillus polymyxa DN1

HU Fei， SU Weihua， HU Benjin* et al

（Institute of Plant Protection and Agroproducts Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract[Objective] The aim was to discuss solid fermentation condition for Paenibacillus polymyxa DN1. [Method] We optimized the best solid medium and fermentation conditions of Paenibacillus polymyxa DN1 by the single factor and muti factor experiments. [Result] The optimum medium for Paenibacillus polymyxa DN1 was 15% rice husk， 40% corn flour， 20% potato， 10% oilteacake， 15%water， 01% K2HPO4 and 0.2% MnSO4. The optimal fermentation conditions were fermentation time for 72 h， temperature at 37 ℃， pH at 6.5-7.0 and 10% inoculation quantity. The yield and ratio of spore formation were 2.63 billion spores /g and 92%， respectively. [Conclusion] The results provide reference for further study and application of Paenibacillus polymyxa DN1.

Key wordsPaenibacillus polymyxa DN1；Yield；Ratio of spore formation；Fermentation；Optimize

多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）由于其具有植物防病和植物促生作用、對人畜安全和無污染等優點而受到重視，美國環保署（EPA）將其列為可在商業上應用的微生物之一[1]。目前利用多粘類芽孢桿菌防治植物病害的報道較多。例如，國內利用多粘類芽孢桿菌開發出的生物農藥康地雷得對黃瓜枯萎病等有較好防效[2-3]；郭芳芳等[4]發現1株多粘類芽孢桿菌對水稻稻瘟病菌等具有顯著拮抗效果。為提高多粘類芽孢桿菌的產量和芽孢率，許多研究者對芽孢桿菌發酵條件進行優化[5-10]。王哲等[11]采用單因素多濃度和響應面試驗設計法，對菌株 KLBMP 033 液態培養工藝進行了優化。周青等[12] 研究表明，經條件優化后培養的解淀粉芽孢桿菌 BS2004對番茄青枯病的防治效果達 80%。目前多粘類芽孢桿菌多采用液體深層發酵技術，再經噴霧干燥進行生產，對設備要求高，生產工藝復雜，而固體發酵采用的原料一般是廉價的農副產品（如稻殼、麩皮等），采用的設備也較液體發酵簡單，生產成本大大低于液體發酵，近年來各生產廠家都在積極探索芽孢桿菌的固體發酵技術。因此，研究多粘類芽孢桿菌的固態發酵條件可為開發高效、低毒生物農藥提供有效途徑。

安徽省農業科學院植物保護與農產品質量安全研究所篩選的多粘類芽孢桿菌DN-1具有廣譜抗植物病原真菌作用，對離體水稻紋枯病（Rhizoctonia solani Kühn）、油茶炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides Penz）等作用效果顯著。目前，有關多粘類芽孢桿菌固態發酵條件和發酵工藝的研究較少，鑒于此，該研究所進行了多粘類芽孢桿菌DN-1不同組分培養基固體發酵產菌量試驗，以期簡化生產工藝，提高產量和芽孢率，降低生產成本，為進一步應用提供數據支持。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。

多粘類芽孢桿菌DN-1，于青島海域海泥中分離（Genebank登錄號：KM891591），由安徽省農業科學院植物保護與農產品質量安全研究所保存。

1.1.2培養基。

液體種子培養基：馬鈴薯20.0%，葡萄糖20%，氯化鈉 0.5%，磷酸氫二鉀0.1%。

固體發酵培養基：麩皮、稻殼、玉米粉、馬鈴薯、茶渣餅（油茶副產品）、磷酸氫二鉀、硫酸錳。

1.2方法

1.2.1多粘類芽孢桿菌DN-1產菌量測定。

采用混勻平皿活菌計數法，按10倍稀釋法制成不同濃度稀釋液，從各濃度稀釋液中分別吸取0.1 mL 置于無菌培養皿中，每個稀釋濃度做2個平皿。將事先融化并冷卻至50 ℃左右的固體培養基向每培養皿中倒入12.0 mL，搖勻，凝固后放入37 ℃培養箱中倒置培養24 h，進行菌落記數。

1.2.2多粘類芽孢桿菌DN-1芽孢率測定。

采用芽孢革蘭氏染色，顯微鏡下觀察。

1.2.3發酵培養基成分優化。

1.2.3.1

碳源的篩選。分別以40%稻殼、蔗糖、木屑、麩皮和玉米粉作為碳源，40%酵母粉作為氮源。將各組分加入20%水中浸泡4 h，裝袋高壓滅菌45 min，待溫度降到40 ℃左右后接入液體種子菌液，接種量為10%，攪拌混勻，發酵培養。37 ℃發酵72 h后，停止發酵，期間定時取樣檢查，每處理4 次重復。

1.2.3.2

氮源的篩選。分別以 40%酵母粉、黃豆粉、豆粕、馬鈴薯、茶渣餅，40%蔗糖作為碳源。其他條件同“1.2.3.1”，每處理4次重復。

1.2.3.3

無機鹽的篩選。40%酵母粉、40%蔗糖培養基中分別添加 0.2%的 氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸錳、氯化鋅和氯化鈣，其他條件同“1.2.3.1”，每處理4次重復。

1.2.3.4

多種培養基組合試驗。以單因子試驗篩選出的最佳碳源、氮源、無機鹽為基礎，采用多種組合（表1）進行培養基優化，確定培養基各組分的最佳配比。

1.2.4發酵條件的優化。

以“1.2.3”優化后獲得的發酵培養基，對多粘類芽孢桿菌DN-1發酵時間、溫度、初始 pH、接種量等發酵條件進行優化。

發酵時間分別調為24、48、72、96、120 h；溫度分別調為30、32、35、37、40 ℃；初始 pH分別設為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；接種量分別設為5%、7%、10%、12%、15%；測定產菌量和芽孢率，每處理4 次重復。

2結果與分析

2.1發酵培養基成分優化

5種碳源對DN-1菌株菌量和芽孢率具有顯著影響（圖1），以玉米粉的菌量和芽孢率最高，分別達 15.9億/g、79%；稻殼和玉米粉的菌量、芽孢率均顯著高于其他碳源。綜合考慮生產成本，選擇玉米粉和稻殼作為后續發酵碳源。

5種氮源對DN-1菌株產菌量和芽孢率影響不同（圖2），其中酵母粉、茶渣餅、馬鈴薯顯著高于其他氮源，以茶渣餅的菌量和芽孢率最高，分別達 17.4億/g、84%；土豆的芽孢率高于酵母粉，但菌量兩者差異不顯著。為了降低生產成本，選擇馬鈴薯和茶渣餅作為發酵的綜合氮源。

5種無機鹽對DN-1菌株產菌量和芽孢率影響也不同（圖3），硫酸錳和磷酸二氫鉀的菌量、芽孢率顯著高于其他無機鹽，其中磷酸二氫鉀菌量達15.1億/g；硫酸錳芽孢率達84%。因此，選擇硫酸錳和磷酸二氫鉀作為發酵用無機鹽。

2.2多種組合培養基的優化

根據單因素試驗結果，選擇稻殼、玉米粉、硫酸錳、茶渣餅、馬鈴薯、硫酸錳、磷酸二氫鉀進行多種培養基組合試驗，分別以菌量和芽孢率為指標，確定發酵培養基成分的最佳配比。由表2可知，處理1培養基組合為最佳水平，菌量和和芽孢率均顯著高于其他組合，分別達26.3億/g、92%。因此，確定DN-1菌株最佳發酵培養基成分為15%稻殼、40%玉米粉、20%馬鈴薯、10%茶渣餅、15%水、0.1%磷酸氫二鉀、0.2%硫酸錳。

2.3發酵條件的優化

時間顯著影響DN-1菌株的菌量和芽孢率（圖4）。隨著發酵時間的增加，菌量和芽孢率逐漸提高，72 h時菌量達到高峰值，分別為24.9億/g、91%，后續至120 h菌量呈穩定趨勢，芽孢率開始下降。因此，確定72 h為DN-1菌株最佳發酵時間。

溫度對DN-1菌株的菌量和芽孢率具有顯著影響（圖5）。隨著發酵溫度的上升，菌量和芽孢率逐漸提高，37 ℃時菌量達到高峰值（25.7億/g），35 ℃時芽孢率最高達89%，但與37 ℃（芽孢率90%）相比差異不顯著。因此，確定37 ℃為DN-1菌株最佳發酵溫度。

初始pH 6.0～8.0 時DN-1菌株均可大量生長，在 pH 6.5～7.0時菌量和芽孢率較高，最高值分別達26.5億/g、94%（圖6）。pH 8.0時菌量和芽孢率都開始下降，說明弱酸條件有利于菌體生長和芽孢率的提高。因此，確定發酵培養基的初始 pH為6.5～7.0。

接種量對DN-1菌株的菌量和芽孢率也具有一定影響（圖7）。隨著接種量的增加，菌量逐漸增加，同時芽孢率也逐漸提高，當接種量為10%時，菌量和芽孢率最高值分別達26.3億/g、92%；隨后接種量繼續增加，菌量和芽孢率略微下降。因此，確定最適接種量為10%。

3結論與討論

試驗以菌量和芽孢率為指標，對多粘類芽孢桿菌DN-1的固態發酵工藝進行優化，最終確定最適培養基配比為15%稻殼、40%玉米粉、20%馬鈴薯、10%茶渣餅、15%水、0.1%磷酸氫二鉀、0.2%硫酸錳，最適發酵條件為發酵時間72 h，發酵溫度37 ℃，初始pH 6.5～7.0，接種量10%。

試驗發現，DN-1菌株對玉米粉和稻殼利用顯著高于其他碳源，稻殼的空隙可能為菌體發酵提供必要的通氣量，馬鈴薯和茶渣餅的組合氮源、錳離子更有利于提高菌量和芽孢率，目前多粘類芽孢桿菌固態發酵培養基中加入錳離子的報道較少。DN-1菌株在72 h時菌量和芽孢率達到高峰，而后續芽孢率開始下降，說明芽孢隨著發酵時間的延長開始逐步轉化為菌體。溫度在 37 ℃以上時菌量和芽孢率開始下降，說明該菌株發酵溫度不應高于40 ℃。最適初始pH為6.5～

7.0，可能弱酸條件有利于菌體生長和芽孢率的提高。多粘

類芽孢桿菌DN-1其他同類菌株發酵條件不同，它們之間

的差距可能由菌株本身的特性決定的，所以針對不同的菌株

應選擇最適的培養條件。

研究多粘類芽孢桿菌固態發酵工藝等具有十分重要的意義，可為與井岡霉素A復配加工成可濕性粉劑提供技術支持。發酵過程是一個動態變化的過程，該研究對發酵條件的篩選只涉及室內中試條件，所得數據只能作為實際生產參考，規模化生產還必須進行工業化生產工藝的研究。

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