泰國斗魚玈ox9基因的克隆及組織表達研究

賀超 洪廣 吳靜嫻 馮正陽 王文基 陳華譜 朱春華 李廣麗

摘要[目的]克隆性別調控基因Sox9的cDNA序列，為后續開展Sox9分子進化及性別調控功能的研究提供參考。[方法]從泰國斗魚中克隆鑒定出Sox9基因的cDNA序列全長，并展開序列分析及在雌雄個體中的組織分布研究。[結果]利用Smart-RACE的分子克隆方法，從泰國斗魚精巢中克隆得到Sox9基因的cDNA序列，全長為2 201 bp，其中開放讀碼框1 449 bp；氨基酸比對分析顯示Sox9氨基酸序列中的HMG序列的保守性相當高；通過系統進化樹分析發現泰國斗魚Sox9與半滑舌鰨的親緣關系最近；利用RT-PCR的方法檢驗了泰國斗魚Sox9基因在雌雄個體中的組織分布，結果發現泰國斗魚Sox9基因在雌性的肌肉中表達量最高，其次在腦和腸中，而在卵巢未檢測到表達信號；在雄性中，Sox9基因在腦和精巢中的表達量最高。[結論]泰國斗魚Sox9具有保守的結構特征，并且在組織分布中顯示出表達特異性及性別差異性。

關鍵詞泰國斗魚；Sox9；序列分析；組織分布

中圖分類號S917.4文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）08-0151-05

Study on Cloning and Tissue Expression of Sox9 in Betta splendens

HE Chao，HONG Guang，WU Jingxian，CHEN Huapu* et al（Key Laboratory of Marine Ecology and Aquaculture Environment of Zhanjiang，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088）

Abstract[Objective] To clone the fulllength cDNA sequence of sexual regulation gene Sox9 ，to provide a basis for the molecular evolution and functional studies of Sox9 in Betta splendens.[Method]The Sox9 cDNA sequence in B.splendens was cloned.Sequence analysis and research of organizations distribution in the male and female individual was carried out.[Result]The Sox9 cDNA sequence in the testis of B.Splendens was cloned by using the rapidamplification of cDNA ends （RACE），it contained 2 201 bp nucleotides with the open reading frame （ORF） of 1 449 bp；the amino acid sequence alignment showed that the HMG （the high mobility group box） domain of Sox9 was rather conserved； based on the phylogenetic analysis，the B.splendens Sox9 protein was closer to Cynoglossus semilaevis；tissue distribution analyzed by RTPCR showed that the expressions of Sox9 were highly expressed in muscle，moderate in brain and gun，and undetectable in ovary in female； high expression level of Sox9 was found in testis and brain in male.[Conclusion]The Sox9 in B.Splendens shows conservative structural characteristics，tissue express specificity and gender differences.

Key wordsBetta splendens；Sox9；Sequence analysis；Tissue distribution

Sox（SRYrelated high mobility group box）家族目前已經被克隆鑒定出30多個成員。Sox家族成員均含有79個高度保守HMG盒（high mobility group box）的結構域，主要是與下游調控基因的DNA結合，成為Sox家族成員的最顯著性結構特征[1]。其中Sox9被認為是Sox家族中與性別分化較相關的成員之一[2]，受到了廣泛的關注與研究。在哺乳類、鳥類和爬行類的性分化時期，Sox9基因在雄性生殖嵴的表達量急劇上調[3-5]。在小鼠中，雌性性腺中Sox9的異常表達導致了睪丸的形成[6]。Sox9基因的缺失會造成雄性逆轉成為雌性，從而表明Sox9基因在精巢發育中起了至關重要的作用，并被認為是雄性性別決定因子[7]。但在后續的研究中發現，在成年小鼠卵巢中，Sox9在卵泡發育過程中同樣扮演著重要的調控角色，顯示出Sox9在雌雄發育調控中的雙重生理功能[8]。

魚類的性腺發育具有多種形式，如雌雄異體、雌雄同體、先雌后雄和先雄后雌等。魚類多樣化的發育模式為研究性別分化機制提供了更加理想的模型。Sox9作為公認的性別分化調控因子之一，在魚類研究中同樣受到了廣泛的關注。目前已經在斑馬魚（Danio rerio） [9]、 鱔魚（Monopterus albus）[10]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss） [11]、青鳉（Oryzias latipes）[12]、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides） [13]、大西洋鱈魚（Gadus morhua） [14]、金錢魚（Scatophagus argus） [15]和胡子鯰 （Clarias batrachus） [16]等魚類中展開研究，證實Sox9在魚類性別分化中發揮著重要的作用。但由于魚類屬于低等的脊椎動物，易受外界因子的影響，導致性別的可塑性較高，因此需要在更多的魚類中進行拓展研究，才能更好地從差異中獲得共性結果，從而更好地闡述Sox9基因在魚類中的性別調控功能。

泰國斗魚（Betta splendens）原產于泰國，又被稱為彩雀魚，是一種重要的熱帶小型淡水物種，同時是一種被廣泛養殖的觀賞魚。泰國斗魚雌雄個體差異十分明顯，雄性天生好斗，色彩豐富多樣，環境適應能力強，價格便宜，易于飼養，是一種研究魚類生理功能的理想模型。目前對泰國斗魚的分子生物學研究較少，筆者以泰國斗魚為研究對象，利用現代分子克隆的技術方法，從泰國斗魚的精巢中克隆鑒定出Sox9基因的cDNA序列全長，并開展了Sox9基因相關序列的結構分析及組織表達分布研究，為深入闡明Sox9基因在泰國斗魚中的生理功能奠定了基礎。

1材料與方法

1.1試驗魚試驗用魚（泰國斗魚）購于廣東省湛江市霞山區花鳥市場。試驗中，將泰國斗魚置于冰上麻醉，等其失去知覺后，將其肌肉、性腺、腦、垂體、心臟、肝、腎、脾、腸等組織或器官取出，液氮速凍，然后保存于-80 ℃ 超低溫冰箱中備用。

1.2試劑

總RNA提取試劑Trizol Reagent購于Life公司； DNase Ⅰ和the ReverTraAce-a first-strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購于TOYOBO公司；Smart-RACE試劑盒購于TaKaRa Clontech公司；Taq酶和載體pTZ7R/T購于MBI Fermentas公司； 質粒提取和膠回收試劑盒購于廣州東盛公司；化學試劑均為國產分析純試劑。

1.3序列比對與引物設計

通過NCBI 基因庫的序列搜索比對，找出與泰國斗魚Sox9序列同源性最高的魚類Sox9序列。通過比對分析，根據序列的保守結構，設計出用于泰國斗魚Sox9基因克隆與組織表達分析等的引物（表1）。

1.4總RNA提取

根據Trizol reagent試劑盒說明書的要

求操作，獲得泰國斗魚各組織的總RNA。總RNA的濃度和完整性分布利用核酸測定儀和瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5分子克隆

以泰國斗魚精巢的總RNA作為模板，利用the ReverTraAce-a first-strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉錄合成克隆Sox9中間片段的cDNA模板，并通過中間片段克隆引物的擴展，克隆獲得泰國斗魚Sox9基因的cDNA中間片段序列。然后根據中間片段，設計5′和3′Race的特異克隆引物。根據Smart-RACE試劑盒的說明書進行克隆，分別獲得泰國斗魚Sox9基因5′和3′端的序列，然后通過拼接，獲得cDNA序列全長。最后通過全長特異引物驗證，獲得確切的Sox9 cDNA序列全長。

1.6序列分析

利用DNAtool6.0軟件分析泰國斗魚Sox9基因的cDNA序列，確定其開放讀碼框（Open Reading Frame，ORF）并推導氨基酸序列，用 ProtParam 軟件預測蛋白分子量及理論等電點等參數。使用Clustalx1.8進行氨基酸序列比對分析，并用MEGA4.0軟件構建系統進化樹。

1.7組織分布從各個組織的總RNA中吸取1 μg，用DNase Ⅰ將基因組DNA去除，然后根據第一鏈cDNA合成的說明書合成cDNA模板。利用泰國斗魚Sox9基因的特異引物與β-actin基因作為內參，進行組織分布的半定量檢測。試驗所用的反應體系為25 μL，循環條件為 94 ℃預變性4 min；接著94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，40個循環，72 ℃延伸1 min，吸取8 μL PCR產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用天能Tanon2500R凝膠成像分析系統進行拍照與半定量分析。

2結果與分析

2.1泰國斗魚Sox9基因的cDNA序列全長

利用DNAStar軟件去除載體序列并將其進行拼接，得到泰國斗魚Sox9完整的cDNA序列。泰國斗魚Sox9 cDNA全長為2 201 bp，包括 5′非翻譯區（5′-UTR）109 bp，3′非翻譯區（3′-UTR）554 bp，開放閱讀框（ORF）為1 449 bp（圖1）。其中在第104～172 aa之間為Sox9 HMG-box，在該盒內存在1個特征性基序AQAARRKL，2個核定位信號 NLS（NLS1：KRPMNAFMVWAQAARRK；NLS2：RRRK）。用 ProtParam 軟件預測泰國斗魚Sox9 蛋白分子量為 52.972 kD，理論等電點為 6.23。

2.2泰國斗魚Sox9的氨基酸序列比對及同源性分析 將泰國斗魚Sox9與已知魚類的Sox9序列進行同源性分析（圖2），結果顯示泰國斗魚Sox9蛋白前體和其他魚類的Sox9蛋白類似，均具有Sox家族的特征性結構。 泰國斗魚Sox9蛋白前體中的HMG結構域和其他魚類HMG結構域同源性較高，顯示出高度的保守性，只有1個氨基酸殘基的差異。另外，在HMG結構域內同樣存在1個特征性基序AQAARRKL，以及2個核定位信號NLS1和NLS2。

2.3泰國斗魚Sox9系統進化樹分析

利用鄰位相連算法構建泰國斗魚以及其他脊椎動物Sox9蛋白的系統進化樹（圖 3），結果顯示泰國斗魚的Sox9蛋白與其他魚類聚為一簇，其中與半滑舌鰨的親緣關系最近，其次是尖吻鱸、斜帶石斑魚、金錢魚和黃鱔等，與雞、小鼠和人類等高等脊椎動物的親緣關系較遠。

2.4泰國斗魚Sox9基因的組織分布

利用RT-PCR半定量的方法分析Sox9基因在泰國斗魚雌雄個體不同組織中的表達情況。在雌性中，Sox9在肌肉中的表達量最高，其次為腦和腸組織，在腎臟和胃檢測到較低的表達量，在垂體中檢測到微弱的表達信號，在肝臟、卵巢和心臟中均檢測不到表達信號。在雄性中，Sox9在腦和精巢中的表達量較高，其次是腎臟和肌肉，在垂體、肝臟、腎臟、心臟和腸中均未檢測到表達信號。

3結論與討論

通過現代分子克隆技術方法，克隆獲得泰國斗魚Sox9基因的cDNA序列全長。通過序列分析，發現泰國斗魚的Sox9與其他魚類的Sox9蛋白一樣，具有Sox家族成員典型的HMG結構，并且顯示出高度的保守性[1]。泰國斗魚Sox9蛋白與其他魚類的Sox9蛋白序列長度和大小相似，并均具有Sox9因子其他的重要結構特征，如2段核定位信號序列NLS1和NLS2，及HMG區域中的特征基序（AQAARRKL）[1-2]。這些基序的高度保守，表明了Sox9蛋白在結構進化過程中的保守性，同時也預示著生理功能在進化過程中的保守。

利用鄰位相連算法進一步分析泰國斗魚及其他脊椎動物Sox9蛋白的系統進化關系，結果表明，泰國斗魚與半滑舌鰨的親緣關系最近，其次是尖吻鱸、斜帶石斑魚、金錢魚和黃鱔等魚類，而與同為鱸形目的羅非魚和海鱸的親緣關系比其他目的魚類還要遠，從而顯示出Sox9蛋白的系統進化與物種的進化地位不相一致。這可能與魚類的基因組結構相關。魚類基因組在進化過程中，經歷了3次基因組復制，導致很多基因發生了多亞型化，一般會同時存在2種或幾種亞型。已經在多種魚類中發現了Sox9基因存在2種亞型[9-10，12]，分別是Sox9a和Sox9b。由于多亞型的存在，可能會導致Sox9蛋白在系統進化樹構建中聚類發生改變。后續需要在更多物種中拓展研究，將Sox9的各個亞型進行克隆鑒定，才能進一步完善Sox9蛋白分子的系統進化樹。

通過RT-PCR的方法檢測了泰國斗魚在雌雄個體中的組織分布情況，結果分析發現泰國斗魚Sox9基因具有顯著的組織表達特異性和雌雄差異性，預示了Sox9具有多種生理調節功能及雌雄功能的差異。泰國斗魚的組織分布和其他魚類一樣，均具有組織表達特異性及雌雄差異性[9-10，12]。在雌性泰國斗魚中，Sox9 mRNA在腦中的表達量均較高，與金錢魚[15]、虹鱒[11]、斜帶石斑[13]和鯰魚的研究相一致，表明Sox9在上游神經系統中的重要生理功能。另外，該研究還發現Sox9基因在精巢中具有高表達，而在卵巢中檢測不到表達信號，這與胡子鯰[16]和斑馬魚[17]Sox9a基因的表達情況相一致，從而表明泰國斗魚Sox9在雄性發育中具有十分重要的作用，并可能和其他物種一樣，起到性別決定的作用。后續需要開展更多的研究，進一步闡明泰國斗魚Sox9基因在性別調控中的確切功能。

該研究從泰國斗魚中克隆鑒定出Sox9基因的cDNA序列全長，并展開了序列分析及在雌雄個體中的組織分布檢測。序列分析結果表明，泰國斗魚Sox9具有保守的結構特征，并且在組織分布中顯示出表達特異性及性別差異性。這為深入探討Sox9基因的分子進化及生理功能奠定了研究基礎。

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