超臨界C0₂提取延胡索乙素最優(yōu)工藝條件探索

劉雷 祁俊生 梁克中 陳書鴻 黃美英 周濃

摘要：文章通過設計四因素三水平正交實驗，探索超臨界CO2流體萃取法提取延胡索乙素的最優(yōu)工藝條件。利用SFE-CO2法提取延胡索中的延胡索乙素；利用HPLC法測定萃取物中延胡索乙素的含量。經(jīng)實驗探究，確定的最佳工藝條件為：延胡索粒度為30目，萃取壓力20Mpa，萃取溫度45℃，改性劑為飽和Ca（OH）2溶液，夾帶劑為藥材1.5倍量的95%乙醇。該工藝穩(wěn)定可行，可用于延胡索乙素的提取。

關鍵詞：延胡索；延胡索乙素；超臨界C02流體萃取法；高效液相色譜法

延胡索（Corydalis yanhusuo），又名元胡、玄胡、元胡索等，為大宗常用中藥，屬“浙八味”之一。塊莖為著名常用中藥，具有活血散瘀、行氣止痛的功效。其內含有延胡索甲素、延胡索乙素等20多種生物堿[1]。延胡索乙素又名鹽酸四氫巴馬丁，四氫掌葉防己堿。熔點在147～149℃，遇光受熱顏色漸變深。中國藥典（2015年版一部）以延胡索乙素為指標，對延胡索藥材規(guī)定了TLC定性鑒別和HPLC含量測定方法，己成為延胡索及其制劑進行質量評價的重要依據(jù)[2]。

超臨界CO2流體萃取法是國際上較先進的物理萃取技術，陳峰[3]、包瑋鴛[4]等分別從萃取壓力、萃取溫度等因素設計正交實驗，探索SFE-CO2法提取延胡索乙素的最優(yōu)工藝條件。此外，在延胡索乙素提取過程中，SFE-CO2法與醇回流提取法等傳統(tǒng)的提取方法相比較，工藝穩(wěn)定可行，優(yōu)于其他傳統(tǒng)提取方法[5]。本研究在前人工作的基礎上，進一步探究超臨界CO2流體萃取過程中各項參數(shù)對延胡索乙素萃取率的影響，進而探究其更為完善的最佳工藝條件。

1 實驗部分

1.1儀器與藥劑

HA120-50-01超臨界萃取裝置（江蘇南通華安超臨界萃取有限公司），LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津集團），DZF-6050MBE型電熱恒溫真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司），SB-5200DTN型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），RVIO基本型立式旋轉蒸發(fā)儀（IKA旋轉蒸發(fā)儀公司），CP225D型分析天平（德國Sartorius公司）。

延胡索藥材（浙江東陽），延胡索乙素對照品（批號：110726-210213，中國食品藥品檢定研究院），延胡索對照藥材（批號：120928-201208，中國食品藥品檢定研究院），工業(yè)二氧化碳（萬州區(qū)三牧氣體有限公司），其余試劑均為分析純。

1.2實驗方法

1.2.1延胡索乙素的SFE-CO2法提取

選取延胡索塊莖若干，清洗，40℃條件下烘干，粉碎，制備大、中、小3個梯度延胡索粉末若干以備用。

精密稱取相應粒度的延胡索粉末200g，與適量的堿性飽和Ca（OH）2溶液混合拌勻，于25℃恒溫條件下密閉保存24 h。裝入1L的萃取釜中，啟動超臨界萃取裝置，萃取釜壓力、溫度按正交表L9（34）設計的實驗參數(shù)進行設定。當分離釜I壓力達到6Mpa、溫度達到40℃，分離釜Ⅱ壓力達到4Mpa、溫度達到30℃，CO2流量基本穩(wěn)定在20～40 kg/h后，從夾帶劑泵處注入95%的乙醇，夾帶劑用量依據(jù)正交表L9（34）設計的實驗參數(shù)進行選擇。穩(wěn)定萃取2.5 h后，依次關閉裝置閥門，停止萃取。期間間隔一段時間用潔凈大燒杯于分離釜I和分離釜Ⅱ處收集萃取物。

1.2.2延胡索乙素的HPLC法測定

用旋轉蒸發(fā)儀將所收集的萃取液濃縮蒸干，待蒸干瓶溫度降低至接近室溫后，加入80%的甲醇溶液溶解，利用超聲波震蕩至壁上無殘留后，定容至50 mL容量瓶中，靜置，取上層澄清液進行液相色譜測定。

色譜條件：色譜柱為Durashell C18色譜柱（250 mmx4.6 mm，5μm）；流動相A相為乙腈―水（92：8），B相為0.2%冰醋酸溶液（用三乙胺調節(jié)pH至5.05），進行梯度洗脫（0～15 min，20% A→20% A；15～35 min，20% A→80% A）：檢測波長為280nm；柱溫為35℃；體積流速為1.0 mL/min；進樣量為20μL[6]。按照上述色譜條件進行分析，各成分分離度良好，對照品和樣品HPLC圖如圖l所示。

2 結果與分析

2.1單因素預實驗

通過單因素預實驗，探索在超臨界CO2流體萃取過程中，藥材粒度、堿化劑、萃取壓力、萃取溫度4個關鍵因素對延胡索乙素提取率的影響，為后續(xù)正交實驗的設計提供一個合理的數(shù)值范圍。

2.1.1藥材粒度對延胡索乙素提取率的影響

精密稱取30、50、70、90目延胡索粉末各200g，用飽和Ca（OH）2溶液密閉浸泡24 h，裝入1L的萃取釜中，設置萃取釜壓力為15 Mpa，溫度為40℃，其余步驟同“1.2實驗方法”所述。本次單因素實驗以所測得延胡索乙素含量（mg/g）為指標，旨在考察延胡索藥材的不同粒度對提取效果的影響。從實驗結果得出當延胡索目數(shù)為30目時，延胡索乙素提取率較高。

2.1.2有無堿化試劑對延胡索乙素提取率的影響

本實驗在改性劑的選擇中，從基于環(huán)境友好型溶劑考慮，放棄選用如三乙胺、氨水-乙醇溶液等與生物堿相容性較高但對環(huán)境有污染的化學試劑作為改性劑，選用飽和Ca（OH）2溶液作堿化試劑。其優(yōu)勢有兩點：其一，Ca（OH）2屬于無機堿性溶液，除對延胡索乙素這種生物堿具有堿化效果外，對不銹鋼萃取釜的腐蝕性也相對其他有機溶劑較小；其二，Ca（OH）2溶液還可去除粘液性物質，對減少萃取液色譜圖中的雜質峰數(shù)量有一定作用。

稱取6份30目延胡索粉末各200g，分為甲、乙兩組，甲組使用飽和Ca（OH）2溶液浸泡24h進行預處理，乙組不做任何堿化處理。分別按照2.1.1中提及的相關參數(shù)及方法條件提取3次，合并3次提取液，蒸干濃縮，HPLC測定，計算萃取率。由實驗結果顯示，使用飽和Ca（OH）2溶液浸泡的延胡索樣品萃取率為0.81mg/g，未做任何堿化處理的取率為0.72mg/g，對比可知，樣品堿化后萃取的效果優(yōu)于未做堿化處理的。

2.1.3萃取壓力對延胡索乙素提取率的影響

稱取12份延胡索粉末（30目）各200g，分別在萃取釜設定壓力為10Mpa、25Mpa、40Mpa、55Mpa的條件下提取3次，其余條件均依照2.1.1中提及的相關參數(shù)及方法進行。合并3次提取液，蒸干濃縮，HPLC測定，計算萃取率。從實驗結果得出，25 Mpa條件下提取效果較好。

2.1.4萃取溫度對延胡索乙素提取率的影響

稱取12份30目延胡索粉末各200 g，分別在萃取釜設定溫度為25℃、45℃、65℃的條件下提取3次，其余條件均依照2.1.1中提及的相關參數(shù)及方法進行。合并3次提取液，蒸干濃縮，HPLC測定，計算萃取率。從實驗結果得出，35℃條件下提取效果較好。

2.1.5萃取過程中夾帶劑的選擇

本實驗在夾帶劑的選擇中，基于延胡索乙素的理化性質及無毒環(huán)保性考慮，選取乙醇作為萃取夾帶劑。

2.2正交實驗

2.2.1正交因素水平確定

依據(jù)超臨界制CO2流體萃取工藝特點，以及上述單因素預實驗的基礎上，選取萃取壓力（A）、藥材粒度（B）、萃取溫度（C）、夾帶劑用量（D）4個因素，每個因素各取3個水平進行正交實驗，以所得萃取物中延胡索乙素的含量作為考察指標。具體因素水平如表1所示。

2.22實驗結果及數(shù)據(jù)處理

按照上述L。（34）正交實驗因素水平表，共進行了9組實驗，每組設3個平行。正交實驗有關數(shù)據(jù)及其計算結果如表2所示。

2.2.3方差分析

用SPSS軟件（22.0）對測定結果進行方差分析，以延胡索乙素含量為考察指標，方差分析結果如表3所示。

從上述正交實驗的結果中可以得出，最佳萃取條件為AIB2C3D2；因素的主次順序為：B>D>A>C，故B2D2AIC3為超臨界CO2流體萃取的最佳實驗條件，即：延胡索粒度為30目；夾帶劑為藥材質量的1.5倍量；萃取壓力為20 MPa；萃取溫度為45℃。

2.3驗證實驗

稱取30目a、b、c3份延胡索粉末各200g，按上述最佳工藝條件進行萃取，測定，計算，結果顯示，a、b、c3組萃取率分別為1.08、1.16、1.23 mg/g，由此可知，延胡索乙素的提取率在3次重復實驗中均處于較高水平，說明該工藝穩(wěn)定可行。

3 結語

本研究在前人研究工作的基礎上，另辟蹊徑，在萃取溫度、萃取壓力、藥材粒度與改性劑用量之間構建新的排列組合關系，在結合單因素實驗的基礎上，通過正交實驗探尋上述4個要素條件下的最優(yōu)工藝條件。

經(jīng)過實驗探究發(fā)現(xiàn)，用SFE-CO2法提取延胡索乙素，相較于索氏提取法、醇回流提取法、以及超聲波一甲醇回流提取法（藥典法）等傳統(tǒng)提取工藝，具有操作溫度低、耗能低、時間短、有效成分含量高、無有機殘留等優(yōu)點。該工藝方法穩(wěn)定可行，可擴展到“中試”生產當中，并可作為中藥材重要有效成分提取的一種高效的方法。

采用本研究中正交實驗所探究的最優(yōu)工藝條件進行驗證性實驗，測得每克延胡索藥粉含有延胡索乙素達1.23 mg，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的提取工藝，也優(yōu)于同類型SFE-CO，法的提取效果[7]。在A383C2D1組實驗中，萃取效率陡然降低，究其原因，可能是由于在使用高目數(shù)，高壓力的條件下，因藥材研磨程度較細，與夾帶劑乙醇溶液混合后，加之在最大設定壓力的沖擊下，萃取物質以稠狀形式存在，堵塞了萃取釜的聯(lián)通孔隙，以至C02流通不暢，造成最終萃取效率較低。

[參考文獻]

[1]張曉麗，王喆星，吳利軍.延胡索化學成分研究[D].沈陽：沈陽醫(yī)科大學，2008.

[2]國家藥典委員會編中華人民共和國藥典（2015年版一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[3]陳 峰，郭立瑋，井山林，等.超臨界C02流體萃取延胡索中延胡索乙素的正交實驗研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2005，16（2）：137-138.

[4]包瑋鴛，吳立成，何忠平，等超臨界C02流體萃取法提取延胡索乙素[J].中藥材，2004，27 （7）：501-503

[5]王玳珠，井山林，陳峰，等.SFE等方法提取延胡索中延胡索乙素的研究[J].南京中醫(yī)藥大學學報，2003，19 （6）：356.

[6]祁俊生，張靜，周 濃，等HPLC同時測定不同產地延胡索中6種.生物堿的含量[J].華西藥學雜志，2016，31（4）：415-419.

[7]原永芳，李修祿，柳正良，等超臨界流體萃取法及高效液相色譜法分析延胡索中延胡索乙素的含量[J].藥學學報，1995，31（4）：282-286.