黃瓜根際促生真菌的篩選及促生效應研究

滕安娜 趙京嵐 王燕

摘要 [目的]篩選黃瓜根際促生真菌，并探索其促生效應。[方法]以解磷、產IAA和拮抗黃瓜枯萎病菌能力為篩選標準測定初篩菌株的多項促生能力；通過種子萌發和盆栽試驗測定菌株對黃瓜的促生效應；通過形態鑒定和rDNA-ITS序列分析對促生菌株進行分類學鑒定。[結果]從連作黃瓜根際土壤中分離到1株同時具解磷、產IAA和拮抗黃瓜枯萎的真菌，該菌株孢子懸浮液能有效促進黃瓜種子萌發和幼苗生長。形態學和分類學鑒定結果顯示該菌株為哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。[結論]所篩選的促生真菌能有效改善黃瓜連作障礙，為開發研制黃瓜專型促生制劑提供良好的種質資源。

關鍵詞 連作障礙；根際促生真菌；哈茨木霉

中圖分類號 S642.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）06-0039-02

Screening of Plant Growth-promoting Rhizofungi and the Promoting Effects on Cucumber

TENG An-na1 ，ZHAO Jing-lan1，WANG Yan2

（1.Department of Biotechnology Engineering，Taishan Polytechnic，Taian，Shandong 271000；2.Dongying Entry-Exit Insperction and Quarantine Bureau，Dongying，Shandong 257000）

Abstract [Objective]To screen plant growth-promoting rhizo fungi and study the growth-promoting effect. [Method]The growth-promoting effects of screening rhizofungi were measured by the standard of the abilities of phosphate solubilization， production of indoleacetic acid （IAA） and antagonistic activity against Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum.Seeding germination and pot experiments were conducted to measure the growth-promoting effects on cucumber.The growth-promoting rhizofungi were classified and indentified by morphological and rDNA-ITS sequence analysis. [Result]One strain was isolated which had the abilities of phosphate solubilization， production of IAA and antagonistic activity against F. oxysporum f.sp.cucumerinum. The spore suspension of this strain could improve germination and promote cucumber seedling growth， which was indentified as Trichoderma harzianum by morphological and rDNA-ITS sequence analysis.[Conclusion]The isolated growth-promoting rhizofungi could solve the continuous cropping obstacles of cucumber and will be helpful for developing the specially microbial inoculants or bio-organic fertilizers of cucumber.

Key words Continuous cropping obstacles；Plant growth-promoting rhizofungi；Trichoderma harzianum

黃瓜是設施蔬菜生產中的主要栽培作物，其連作障礙日益嚴重，土壤肥力下降，枯萎病發病嚴重，造成黃瓜產量和品質下降。連作障礙已成為制約我國黃瓜產業發展的瓶頸。

根際是由植物根系與土壤微生物之間相互作用形成的獨特圈帶，其中植物根際促生細菌（Plant growth-promoting rhizobacteria）研究較為廣泛，大量數據顯示，這類促生菌一般具有固氮、解磷、釋鉀、產生植物激素和分泌抗生素等能力或至少其中1種能力，可促進植物生長、防治病害、增加作物產量[1]。真菌作為土壤微生物群落的重要組成部分，對植物生長發育有重要影響，但目前對根際促生真菌（Plant growth-promoting rhizofungi）的研究和報道較少。

促生菌對植物有一定的種屬專一性和選擇性。為解決黃瓜連作障礙問題，該研究從其根際土壤中篩選具有促生效應的真菌，為進一步開發具促生防病效果的根際真菌提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

黃瓜根際土壤采自泰山職業技術學院實習基地；黃瓜種子為新津研4號；病原菌為黃瓜枯萎病原真菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）。

1.2 促生真菌篩選

取10 g黃瓜根際土壤加入到裝有90 mL無菌水的三角瓶中，28 ℃、170 r/min振蕩培養30 min，梯度稀釋后，分別取0.1 mL稀釋液涂布于PDA平板上，28 ℃培養48 h，挑取菌落形態各異的真菌，純化后編號保存。

1.2.1 解磷能力測定。

將分離純化的菌株點接至含不溶性磷酸鹽的培養基中，通過透明圈試驗，篩選出具備解磷能力的菌株[2]。解磷能力定量測定采用鉬酸銨比色法，以不接菌培養基中有效磷含量為對照[3]。

1.2.2 產IAA能力測定。

將分離純化后的菌株接種于液體查氏培養基中（含誘導物色氨酸0.5 g/L），用Salkowski試劑篩選出產IAA的菌株。用分光光度法定量檢測產IAA能力，以不添加誘導物的培養基中IAA含量為對照[4]。

1.2.3 抑菌能力測定。

將黃瓜枯萎病菌（提前2 d接種）和已分離純化的菌株接種至PDA培養基中，通過對峙培養篩選出能拮抗黃瓜枯萎的菌株，并于顯微鏡下觀察菌絲體的作用方式。

1.3 種子萌發試驗

將待測菌孢子懸浮液加入半固體MS培養基中至終濃度1×106個/mL 。精選大小一致、顆粒飽滿、無缺損的黃瓜種子，表面消毒后播于上述半固體MS培養基中，以無菌水為對照，36 h后測黃瓜萌發率，10 d后測黃瓜胚根生長狀況[5]。

1.4 盆栽試驗

待黃瓜幼苗兩葉一心時選取大小一致的植株，用待測菌孢子懸浮液（1×106個/mL）進行灌根處理，以無菌水為對照，15 d后測量黃瓜幼苗的株高、地上鮮重以及植株葉片磷、硝態氮、葉綠素、類胡蘿卜素的含量[6]。

1.5 菌株鑒定

根據菌落和孢子形態特征及rDNA-ITS序列分析對菌株進行鑒定，采用NCBI的BLAST以及Clustalx1.83、MEGA5.1軟件進行多重序列比較，構建系統發育樹（Bootstrap值=1 000）。

1.6 數據處理

采用Excel與SPSS 19.0軟件進行數據的統計分析。

2 結果與分析

2.1 促生真菌篩選

通過初篩共獲得12株真菌，其中T3-5兼具解磷（圖1）和產IAA能力（圖2），并對黃瓜枯萎病菌有良好的拮抗作用和重寄生作用（圖3、4），將該菌株作為供試菌株用于種子萌發和盆栽試驗。

2.2 種子萌發試驗

T3-5孢子懸浮液可有效提高黃瓜種子萌發率并促進胚根發育（圖5），與對照相比，黃瓜種子萌發率提高23.3%，胚根長增加12.6%，側根原基數目增加26.2%。

2.3 盆栽試驗

T3-5孢子懸浮液灌根處理15 d可促進黃瓜幼苗生長（圖6），株高、地上鮮重分別比CK增加 11.38%、38.47%，葉片磷含量、硝態氮含量、葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量分別提高了19.86% 、12.72%、56.24%、21.23%、39.59%。

2.4 菌株鑒定

菌落暗綠色，背面不變色。孢子梗叢束疏松，瓶梗短，基部變細，中間膨大。分生孢子球形，短倒卵形。根據分子測序結果與該菌株相近的ITS 序列構建系統發育樹（圖6），該菌株與哈茨木霉（Trichoderma harzianum）位于系統發育樹的同一分支，并與木霉屬的其他種有所區別。

3 討論

黃瓜種植面積不斷擴大，并實現周年生產，但其連作障礙日益凸顯，目前國內外學者主要采用農業和化學措施來緩解連作障礙問題，但由于化肥、農藥的大量使用對環境造成了嚴重污染，因此生防菌的施用成為連作障礙防治研究熱點。該研究從黃瓜根際土壤中篩選出1株具有促生防病效果的哈茨木霉T3-5，擬為開發研制黃瓜專型促生制劑提供良好的種質資源。

試驗結果顯示，T3-5具有解磷、產IAA和拮抗黃瓜枯萎病菌能力，這與已報道的哈茨木霉特性相吻合。國內外已有大量研究報道木霉屬菌株可以促進植物種子萌發、植株生長和開花、提高作物產量等[7]，但對于木霉菌用于解決連作黃瓜障礙問題研究較少。該研究所篩選菌株的孢子懸浮液能有效促進連作黃瓜幼苗生長，對于該菌株的促生效果、促生機制及菌肥的制備還有待進一步研究探討。

參考文獻

[1] 胡江春，薛德林，馬成新，等.植物根際促生菌（PGPR）的研究與應用前景[J].應用生態學報，2004，15（10）：1963-1966.

[2] 康貽軍，胡健，單君，等.兩株解磷真菌的解磷能力及其解磷機理的初步研究[J].微生物學通報，2006，33（5）：22-27.

[3] GREINER R，HALLER E，KONIETZNY U，et al.Purification and characterization of a phytase from Klebsiella terrigena[J].Arch Biochem Biophys，1997，341（2）：201-206.

[4] 張東艷，劉曄，吳越，等.花生根際產IAA菌的篩選鑒定及其效應研究[J].中國油料作物學報，2016，38（1）：104-110.

[5] CONTRERAS-CORNEJO H A，MACAS-RODRGUEZ L，CORTS-PENAGOS C，et al.Trichoderma virens，a plant beneficial funfus，enhances biomass production and promotes lateral root growth through an auxin-dependent mechanism in Arabidopsis[J].Plant physiology，2009，149（3）：1579-1592.

[6] 王學奎.植物生理生化實驗原理和技術[M].2版.北京：高等教育出版社，2000.

[7] HARMAN G E.Overview of mechanisms and uses of Trichoderma spp.[J]. Phytopathology，2006，96（2）：190-194.