基于高通量測序技術分析石蟬草內生細菌多樣性

靳松　陳澤斌　李育川　夏體淵　趙鳳　任禛

摘 要 以石蟬草根、莖、葉為材料，采用Illumina MiSeq高通量測序技術研究石蟬草內生細菌多樣性。結果表明，根、莖、葉樣品共測得167個OTUs，歸屬于11個門，分別為變形菌門、Ignavibacteriae、芽單胞菌門、梭桿菌門、厚壁菌門、異常球菌-棲熱菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、放線菌門和酸桿菌門，各樣品的菌群組成和多樣性雖有差異，但以變形菌門為優勢菌群，約占62.48%～93.24%。在各樣品菌群豐度最高的10個OTUs中，葉部優勢群落芽孢桿菌屬、根部特有群落粘球菌目與石蟬草中具有抗炎、抗腫瘤活性的物質存在潛在相關性。

關鍵詞 石蟬草；內生細菌；高通量測序；多樣性

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A

Abstract In this study， the species and diversity of endophytic bacteria in the root， stem and leaf of Peperomia dindygulensis Miq. were comprehensively investigated by highthroughput sequencing technology based on Illumina Miseq platform. The results showed that the number of OTUs were 167 in total which belonged to 11 phyla respectively as Proteobacteria， Ignavibacteriae， Gemmatimonadetes， Fusobacteria， Firmicutes， Deinococcus-Thermus， Chloroflexi， Bacteroidetes， Actinobacteria and Acidobacteria. There were differences in the community composition and diversity of endophytic bacteria from different samples， but the dominant groups of 3 samples were Proteobacteria， accounting for 62.48%-93.24%. In this research， it is showed that Bacillus and Myxococcus on genus level were specifically located in the leaf and root， respectively. These may have some correlation with preferable anti-inflammation and anti-tumor effects.

Key words Peperomia dindygulensis Miq.； endophytic bacteria； high-throughput sequencing； diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.017

石蟬草（Peperomia dindygulensis Miq.）系胡椒科草胡椒屬植物，多分布于中國南方各省區。《中華本草》、《云南中草藥選》等對其均有記載，其味辛、性涼，具有清熱解毒、化瘀散結、利水消腫的功效，對肺癌、肝癌、胃癌等有治療作用[1]。

植物內生菌是指定殖于健康植物組織內部，而又不引發宿主植物表現出明顯感染癥狀的一類微生物[2]。在與宿主植物協同共生的過程中，植物內生菌可產生與宿主植物相同或相似的代謝產物，包括萜類、芳香類等化合物，這些物質具有多種生物學活性，如抗菌、降糖等[3]。已有研究表明中藥材中部分活性成分的形成與其內生菌有關，Strobel等[4]分離于紅豆杉韌皮部的內生真菌紫杉霉（Taxomyces anreanae）可以產生紫杉醇或其他紫杉烷類化合物，該類物質對多種惡性腫瘤具有突出療效；崔晉龍等[5]利用3株活性真菌開展了野外誘導白木香產生沉香的試驗，試驗證明此方法可應用于沉香的實際生產；陶金華等[6]研究茅蒼術內生真菌時發現，內生真菌誘導子能有效提高茅蒼術細胞懸浮培養體系中蒼術素的產量。

目前，國內外對石蟬草的研究多集中于化學成分的分離鑒定及其生物活性[1，7]，而忽視了植物內生菌在中藥材形成中所發揮的作用。陳立[1]研究發現石蟬草抗癌活性成分主要集中在氯仿和乙酸乙酯部位，單體化合物以斷聯木脂素活性較好。本試驗以石蟬草根、莖、葉為研究對象，采用16S rRNA擴增子高通量測序技術對石蟬草的內生菌菌群多樣性結構進行分析，旨在探究石蟬草內生細菌種類多樣性，為更好地保護和開發利用石蟬草資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年10月上旬于云南省文山州馬關縣采集生長健壯的石蟬草全株，不同部位樣品從植株分離后立即裝入無菌采樣袋中，低溫保鮮，于48 h內進行內生細菌的分離，取石蟬草根、莖、葉為分析樣品，樣品名依次為ROOT、STEM和LEAF。

1.2 方法

1.2.1 表面消毒 取石蟬草根、莖、葉樣品，用自來水洗凈，75%酒精震蕩浸泡1 min，轉入2%次氯酸鈉震蕩5 min，無菌水漂洗5次。取最后1次漂洗水涂布于NA平板作為對照，以此檢驗表面消毒是否徹底。

1.2.2 DNA提取、PCR擴增和測序 石蟬草根、莖、葉樣品總DNA提取參照陳澤斌等[8]的方法。因植物質體對細菌16S rRNA基因的擴增具有極大的污染，本研究采用多重PCR方法對植物來源污染進行抑制，兩輪PCR體系不變，僅變換引物并更改相應退火溫度。在PCR擴增過程中使用2對引物分別進行兩輪PCR，第一輪PCR為抑制植物質體污染，所用引物為P63F（5'-GTCGAACGGGAAG TGGT-3'）和P1490R（5'-CTTCACTCCAGTCGCAA GC-3'），退火溫度為68 ℃；隨后取第一輪PCR線性擴增產物進入第二輪16S rDNA基因V4區的擴增，其擴增引物為515F（5'-GTTTCGGTGCCAGC MGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-AGTTCCGGACT ACHVGGGTWTCTAAT-3'），退火溫度為54 ℃。16S擴增子PCR體系為10×PCR Buffer for KOD-PlusNeo，5 μL；2 mmol/L dNTPs 5 μL；25 mmol/L MgSO4 3 μL；引物10 μmol/L，各1.5 μL；KOD-Plus-Neo DNA聚合酶，1 μL；ddH2O，32 μL；模板DNA，1 μL。PCR擴增體系為預變性94 ℃，2 min，1個循環；變性98 ℃，10 s，退火，30 s，延伸68 ℃，30 s，26個循環；延伸72 ℃，5 min，1個循環；25 ℃恒溫。16S rRNA基因V4區擴增子PCR產物通過1.5%瓊脂糖凝膠凝膠電泳分離后切膠純化回收，回收產物送成都羅寧生物科技有限公司進行16S rDNA基因擴增子高通量測序。高通量測序文庫使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit試劑盒構建350 bp小片段文庫，隨后使用Qubit 2.0進行濃度定量后使用Illumina公司MiSeq Reagent Kit v3試劑盒在Illumina Miseq測序儀上完成高通量測序。

1.3 數據處理

1.3.1 測序數據處理 根據竇妍等[9]的方法，使用FLASH[10]將Miseq測序得到的PE reads進行拼接，同時對序列質量進行質控，在去除低質量堿基及接頭污染序列等操作過程后完成數據過濾，以產生可供后續分析的高質量目標序列。

1.3.2 多樣性和群落結構分析 在97%的相似性水平上使用UPARSE算法[11]進行OTU操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）聚類。挑選出OTU的代表性序列，使用Greengene數據庫[12]進行物種分類信息的劃分，去除注釋為葉綠體、線粒體以及非細菌界或古菌界的OTU。利用 QIIME[13]軟件對樣品進行Alpha多樣性分析，包括Chao1指數和Shannon指數。運用Mothur和R程序對所得的OTUs數目進行維恩（Venn）分析。

2 結果與分析

2.1 序列處理分析

Miseq測序得到的雙端序列數據，根據PE reads之間的重疊關系，將成對的reads采用PEAR序列拼接算法合并為1條序列后，根、莖、葉共測得原始序列104 695/124 427/33 685條，對雙末端讀長序列的質量進行質控過濾后，得到有效序列89 503/105 597/32 577條，有效序列的長度分布在270～310 bp范圍內，平均長度約300 bp（表1）。

2.2 樣品豐富度分析

由圖1可以看出，隨序列數增加，3個樣品的稀釋曲線變化趨勢相似并逐漸趨于平緩，但均未達到飽和；當序列數在0～500范圍內時，Chao1指數曲線斜率最大，序列數大于500后斜率逐漸變小；3個樣品的Shannon指數值在3左右趨于穩定，并表現為葉>根>莖。3條曲線走勢表明，測序數據量合理，能反映出樣品中細菌的多樣性。

2.3 Alpha多樣性分析

在97%相似性水平下，利用Usearch 軟件將227 677條有效序列分為168個OTUs，其中根113個，莖116個，葉105個，表明根、莖、葉樣品的OUT數目差異不大（表2）。Chao1指數和Shannon指數可分別反映樣品中菌群豐富度和多樣性情況，從表2看，不同部位菌群種類豐富度表現為根>莖>葉，菌群多樣性表現為莖>根>葉，莖相較于根和葉菌群多樣性更為豐富。

2.4 菌群結構分析

采用Greengene軟件進行數據比對，3個樣品的167個OTUs歸屬于11個門（圖2），26個綱，48個目，82個科和104個屬，主要分布在變形菌門（Proteobacteria）、Ignavibacteriae、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）。莖樣品中的細菌分布于11個門，根和葉樣品中的細菌分布于10個門，其中梭桿菌門細菌在根樣品中未檢測到，Ignavibacteriae細菌在葉樣品中未檢測到。變形菌門細菌為根、莖和葉樣品的優勢菌群，分別占總菌群的93.24%、62.48%和67.54%；厚壁菌門細菌為根和葉樣品的次優勢菌群，分別占總菌群的3.15%和18.70%；異常球菌-棲熱菌門細菌為莖樣品的次優勢菌群，占總菌群的25.53%。由此可見，不同部位內生細菌菌群種類和所占比例雖有差異，但變形菌門均為不同部位共有的優勢菌群，所占比例在62.48%～93.24%之間。

為進一步了解不同部位內生細菌的分布和組成情況，選取各樣品中菌群豐度最高的10個OTUs（表3）。3個樣品中菌群豐度最高的10個OTUs的序列比對結果表明（表3），其主要與變性菌門、厚壁菌門、異常球菌-棲熱菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門相似。其中，根為伯克氏菌目（Burkholderiales，22.12%）、Dokdonella（21.88%）、嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas，9.60%）、粘球菌目（Myxococcales，8.22%）、弧菌屬（Vibrio，4.03%）、B-變形菌綱 （Betaproteobacteria，3.25%）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae，3.04%）、海單胞菌屬 （Marinomonas，2.68%）、硫桿菌屬（Thiobacillus，2.27%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，2.01%）；莖為硫桿菌屬（Thiobacillus，30.87%）、Truepera（25.46%）、弧菌屬（Vibrio，6.15%）、Sulfurimonas（4.44%）、海單胞菌屬（Marinomonas，3.87%）、固氮弧菌屬（Azoarcus，3.08%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，2.98%）、綠彎菌門（Chloroflexi，2.63%）、鏈球菌屬（Streptococcus，1.73%）、弓形桿菌屬（Arcobacter，1.35%）；葉為弧菌屬（Vibrio，24.64%）、海單胞菌屬（Marinomonas，13.15%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，12.14%）、動球菌科（Planococcaceae，5.27%）、硫桿菌屬（Thiobacillus，4.62%）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas，3.91%）、Roseiflexus（3.61%）、Truepera（2.66%）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas，2.41%）、弓形桿菌屬（Arcobacter，2.06%）。弧菌屬（Vibrio）、海單胞菌屬（Marinomonas）、硫桿菌屬（Thiobacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）在所有樣品中均有分布；Truepera和弓形桿菌屬（Arcobacter）僅在莖和葉中分布；其他僅在1種樣品中分布。伯克氏菌目（Burkholderiales）在樣品根中含量最高為22.12%；Truepera在樣品莖中含量最高為25.46%；弧菌屬（Vibrio）在樣品葉中含量最高為24.64%。

2.5 樣品間OTUs Venn圖分析

在OTU分析中，維恩圖用于表示多個組樣品的OTU共有和獨有的情況。從圖3可見，3個樣品中有60個相同的OTUs；各樣品兩兩間共有的OTUs個數分別為11、14和21個，其中莖和葉的共有OTUs個數最多；各樣品獨有的OTUs個數分別為13、21和28個，表現為根>莖>葉。

3 討論

植物內生菌具有豐富的生物多樣性，是微生態的重要組成部分，包括內生細菌、內生真菌和內生放線菌[14-16]。中草藥內生菌的相關報道多以內生真菌為主，而內生細菌鮮見報道。黃雅麗等[17]在研究結香和非結香的白木香內生細菌的群落結構及變化時發現，結香前后白木香內生細菌發生顯著的、有規律的變化，因此筆者認為中草藥內生細菌資源的開發利用有待挖掘。

隨著基因測序技術的不斷進步，Illumina MiSeq高通量測序技術已先后應用于環境微生物[18]、腸道微生物[19]等的研究之中，該技術克服了傳統分子生物學方法通量低、信息量小等缺陷，從基因水平上對微生物群落結構進行解析。就植物組織而言，葉綠體和線粒體與細菌在系統發育上具有高度的同源性[20]，采用高通量測序技術進行植物內生細菌的研究時，陳澤斌等[21]發現，在植物內生細菌16S rRNA-V4變異區測序時，會出現宿主污染現象，導致部分豐度較低的OTUs被忽略，從而影響內生細菌多樣性分析結果的全面性和準確性。本試驗為減小宿主污染對試驗結果的影響，在16S rRNA基因PCR擴增階段采用多重PCR方法抑制植物質體污染，使各樣品測試結果中葉綠體豐度降低至18.66%～53.38%，其中葉部最高，由此可見質體污染是植物內生菌研究的重要障礙，能夠在降低質體和線粒體干擾的情況下無偏差地進行微生物多樣性的研究是植物內生菌多樣性研究的重點。

從各樣品菌群豐度最高的10個OTUs分析看，石蟬草內生細菌存在明顯的組織特異性。伯克氏菌目和Dokdonella屬細菌為根部優勢菌群。硫桿菌屬和Truepera屬為莖部優勢群落。弧菌屬、海單胞菌屬和芽孢桿菌屬為葉部優勢群落。其中，芽孢桿菌屬在石蟬草根、莖、葉中均有分布，已有研究結果表明多種芽孢桿菌屬細菌可通過產生脂肽類抗生素和誘導植物系統抗性對植物病原菌產生廣譜抗性[22]，同時芽孢桿菌屬也是產生醫用抗生素的3個主要來源之一[23]；粘球菌目僅存在于石蟬草根部，其廣泛分布于全球各地的土壤中[24]，粘細菌為第三大類次級代謝產物產生菌[25]，研究發現粘細菌能產生豐富的生物活性物質，其抑瘤譜較廣[26]，抗腫瘤活性甚至高于紫杉醇[27]，是發掘藥用活性物質和新型化合物的良好材料[28]。由此推斷，石蟬草部分內生細菌可能與其具有抗炎[29]、抗腫瘤[1]生物活性的化合物存在潛在的相關性。石蟬草活性成分的形成是否與其內生細菌的活動具有密切關系，下一步還需通過分離培養等研究進行驗證。

4 結論

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術，從石蟬草根、莖、葉3個樣品中共獲得167個OTUs，歸屬于11個門，26個綱，48個目，82個科和104個屬，主要門類為變形菌門、Ignavibacteriae、芽單胞菌門、梭桿菌門、厚壁菌門、異常球菌-棲熱菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、放線菌門和酸桿菌門，各樣品的菌群組成和豐度雖有差異，但變形菌門為優勢菌群，約占62.48%～93.24%。本研究更加準確、全面的揭示了石蟬草內生細菌群落結構等重要信息，并利用非培養方法首次發現石蟬草內生細菌與其具有抗炎、抗腫瘤生物活性的化合物具有潛在的相關性，從而為深入了解內生細菌與石蟬草之間的相互作用，甚至進一步研究石蟬草內生菌代謝途徑及其活性成分形成機理提供了有價值的研究成果。

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