劍麻斑馬紋病菌EST—SSR標記開發與評價

吳偉懷　汪涵　汪全偉　習金根　鄭金龍　梁艷瓊　李銳　黃興　楊蕊馨　賀春萍　易克賢

摘 要 劍麻斑馬紋病是劍麻生產中具有破壞性的一種真菌病害。本研究從GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest）中隨機下載10 525條寄生疫霉EST序列，經過去冗余處理后得到5 519條無冗余EST。利用MISA（MIcroSAtellite identification tool）軟件進行SSR發掘，從中共搜索到199個1～6堿基SSR，其中三核苷酸重復基元類型最多，共鑒定到55個，占SSR總數的27.6%；其次是二核苷酸重復基元類型和單核苷酸重復基元類型，分別鑒定到51和47個，各占所鑒定SSR總數的25.6%和23.6%。進一步分析表明，AG/CT二核苷酸重復基元類型為優勢重復類型，占二核苷酸SSR總數的76.5%。而AAG/CTT和AGC/CTG 2個基元類型在三核苷酸中出現頻率最多，分別為15和11次，分別占三核苷酸SSR總數的27.3%及20.0%。從鑒定的199個SSR中，選取含有SSR的合適區段設計了22對引物，并通過18個劍麻斑馬紋病菌菌株的基因組DNA進行了評價，結果只有其中9對引物能從劍麻斑馬紋病菌基因組DNA中有效擴增，其擴增移效率為40.9%。由此表明，利用此方法來開發劍麻斑馬紋病菌的分子標記具有可行性，只是存在一個轉移效率問題。

關鍵詞 劍麻斑馬紋病菌；表達序列標簽（EST）；SSR；分子標記

中圖分類號 Q78；S563.8 文獻標識碼 A

Abstract Zebra spot disease caused by Phytophora nicotianae var. parasitica（or Phytophora parasitica var. nicotianae）is the most serious and devastating fungi disease in sisal. In the present study， a total of 5 519 non-redundant P. nicotianae were generated from the 10 525 publicly available EST sequences by CAP3 software， which used to mine potential microsatellites by microsatellite identification tool（MISA）. A total of 199 SRR was found in P. nicotianae expressed-squence tags data. Of the 199 SSR， the most abundant SSR was the tri-nucleotide type， with the SSR numbers being 55， accounting for 27.6%， followed by the di-nucleotide and mono-nucleotide type， with the SSR numbers being 51 and 47， accounting for 25.6% and 23.6%. Among the di -nucleotide repeats， AG/CT was the most motifs and accounted for 76.5%. The AAG/CTT and AGC/CTG was the most motifs in tri-nucleotide， being 15 and 11， accounting for 27.3% and 20.0%， respectively. Further screening to the number of repetitions and motifs relatively large number of SSR among the 199 SRR， which the right position to develop molecular markers， and a total of 22 primers were developed.Among the 22 primer pairs designed and synthesized， there were only 9 primer pairs that amplified characteristic SSR bands in genomic DNA of 18 tested isolates of P. nicotiana from sisal， thus the transferability was 40.9%. The results showed that it is feasible for molecular markers using this method to develop the sisal zebra germs， only a transfer rate of problems.

Key words Phytophora nicotianae var. parasitica / Phytophora parasitica var. nicotianae； expressed sequence tag （EST）； simple sequence repeat（SSR）； molecular marker

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.018

近年來，隨著分子生物學與生物技術的飛速發展，SSR分子標記技術已成為研究植物病原真菌遺傳變異與檢測的重要手段。傳統基因組來源的SSR（Simple Sequence Repeat，簡單重復序列）引物的開發需要構建基因組文庫、探針雜交和克隆測序等復雜的操作程序。此方法不僅費時、費力，而且開發成本較高[1]。隨著表達序列標簽（expressed sequence tag，EST）技術的迅速發展，EST數據庫為開發SSR標記提供了快速與廉價的途徑[2]。與此同時，由于EST的SSR標記開發是基于基因的轉錄部分，反映了基因的編碼部分，可直接體現基因表達信息，從而與功能基因緊密連鎖，使得其在近緣物種間具有很高的通用性[3]。正因如此，使得EST-SSR標記已成為當今被廣泛利用的分子標記技術之一。目前，該標記已廣泛應用到包括卵菌在內的植物病原菌的群體遺傳變異、多樣性和進化、基因定位等研究中[4-7]。

劍麻斑馬紋病是一種嚴重危害劍麻的主要病害[8]。其病原菌為煙草疫霉（Phytophora nicotianae var. parasitica或表示為Phytophora parasitica var. nicotianae）。中國自1970年首次在廣東省東方紅農場出現此病后，各植麻區都先后不同程度地發生過此病[8，11]。中國劍麻生產以收獲葉纖維為主，其主栽品種‘H.11648栽種歷史已有50 a，其種植面積達到總種植面積98%以上[12]。由于長期大面積單一種植，導致其抗性明顯下降，病蟲害不斷發生[9]。針對劍麻斑馬紋病菌，印度研究者對印度劍麻麻園的斑馬紋病病原菌進行分離鑒定，發現致病菌為煙草疫霉的變種（Phytophthora nicotianae Breda var. parasitica）[13]。趙艷龍等[14]對煙草疫霉菌游動孢子接種劍麻方法進行了研究，結果表明刺傷-棉花保濕法接種劍麻葉片，操作簡單方便，接種成功率高，是利用游動孢子接種劍麻斑馬紋病的最好方法。劉巧蓮[15]則采用菌絲生長速率法對13種藥劑的抑菌效果進行室內篩選 55%敵克松、70%甲基托布津和68%精甲霜·錳鋅的EC50和EC95最小，抑菌效果最好。國內外對劍麻斑馬紋病菌研究主要集中在病原菌鑒定、生物學特性以及致病性與防治藥劑等方面，而未見關于劍麻斑馬紋病菌EST-SSR分子標記方面的報道。為此，本研究擬從GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest）隨機下載寄生疫霉EST序列，經過去冗余處理后，利用MISA（MIcroSAtellite identification tool）軟件進行SSR的查找和分析。在此基礎上，于SSR的側翼區域合適位置設計引物，并通過劍麻斑馬紋病菌基因組DNA進行引物真實性驗證，最終開發適用用于斑馬紋病菌的EST-SSR標記。為后續病原菌遺傳變異及其監測提供分子標記。

1 材料與方法

1.1 材料

從GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest）下載10 525條寄生疫霉EST序列（截至2014年9月2日）。用Blast軟件進行比對，相似度大于80%的就去掉其中一條。EST拼接后從而獲得Unigene；然后，利用MISA（MIcroSAtellite identification tool）軟件對對聚類后的無冗余EST序列進行SSR搜索。篩索標準是：單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸以及六核苷酸最少重復次分別為20、6、5、4、3和3次。

1.2 方法

1.2.1 劍麻斑馬紋病菌菌株及DNA提取 用于本研究的18個劍麻斑馬紋病菌分離物采自不同地方與年份，其具體信息詳見表1。供試各菌株菌絲體收集與基因組DNA提取參照吳偉懷等的方法[16]。

1.2.2 SSR位點引物設計 利用Primer Premier 5.0軟件（http：//redb.ncpgr.cn/modules/redbtools/primer5.php）于SSR的側翼區域合適位置設計引物。設計引物時嚴格按照如下條件進行：復性溫度（Tm）55～60 ℃且上下游引物復性溫度相差小于3 ℃；預期擴增產物片段大小50～300 bp；引物長度17～23 bp，且不形成二聚體及發夾結構等。設計好的引物最終交由Invitrogen公司采用普通脫鹽方式合成。

1.2.3 PCR 擴增及聚丙烯酰胺凝膠電泳 PCR反應體系為20 μL，其中包括14.2 ddH2O，1 μL DNA模板（約50 ng/μL），2 μL 10×EasyTaq Buffer，上下游引物各0.5 μL（10.0 μmol/L），1.6 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.2 μL EasyTaq DNA poly。PCR反應在 Mastercycler gradient Mastercycler PCR擴增儀上進行，擴增反應程序為：94 ℃預變性3 min；隨后94 ℃變性30 s，55 ℃～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增35個循環；最后72 ℃延伸5 min，15 ℃保存。擴增產物經6.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠于北京六一儀器廠生產的DYY-Ⅱ型垂直板電泳儀及DYC-30型電泳槽中電泳分離（電泳緩沖液1×TBE，電壓90 V，時間2 h）。電泳完畢后，銀染顯色，BIORAD凝膠成像系統拍照記錄。

1.2.4 引物的有效性評價 所設計的引物其有效性通過來自于中國不同劍麻栽培區18個劍麻斑馬病菌株進行評價。供試引物只要在18個劍麻斑馬紋病菌株中的任一個擴增出有效條帶即為有效引物，而在18個菌株中擴增出不同DNA大小片段的則記為多態性標記。反之，不能在18個劍麻斑馬紋病菌菌株中擴增出任何條帶則為無效引物。

2 結果與分析

2.1 寄生疫霉菌EST序列中SSR出現頻率與特點

對從GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest）下載10 525條寄生疫霉EST序列，經過去冗余處理后獲得5 519條無冗余EST，總長度為4.05×106 bp。從中共搜索到199個SSR，分布在186條無冗余的EST上，其發生頻率為10.6%（含有SSR的EST與無冗余的EST數之比），SSR平均分布距離為20.4 kb（表2）。其中有13條EST序列中包含1個以上SSR（表2）。在被鑒定到的199個SSR中，單核苷酸、二、三、四、五，以及六核苷酸基元類型SSR分別有47、51、55、5、10和31個，其出現頻率依次為23.6%、25.6%、27.6%、2.5%、5.0%以及15.6%（圖1）。而在EST-SSR重復次數數量方面，出現頻率較高的則是重復數為6、4和7，出現次數分別為40、37、30次（表3）。

2.2 二核苷酸基元組成及其頻率

在199個SSR中，其中二，三核苷酸基元類型分布最為普遍，為此對二者核苷酸基元類型及頻率做更進一步分析。分析結果表明，在51個二核苷酸基元類型SSR中，共存在AC/GT、AG/CT以及AT/AT等3種核苷酸基元類型，其數量依次為5、39及7個，分別占二核苷酸基元類型SSR總數的9.8%、76.5%以及3.7%。由此可見，AG/CT基元為二核苷酸基元類型SSR中最為豐富基元類型（圖2）。

2.3 三核苷酸基元組成及其頻率

在55個三核苷酸SSR中共存在10種不同基元類型。具體而言，AAG/CTT和AGC/CTG 2個基元出現次數最多，分別為15和11次，占三核苷酸SSR總數的27.3%及20.0%。其次為AGG/CCT、ACC/GGT、ACG/CGT和AAT/ATT等4種基元類型出現的次數分別為9、6、5和3，占三核苷酸SSR總數的16.4%、10.9%、9.1%和5.5%。相比之下，ACT/AGT、CCG/CGG、AAC/GTT與ATC/ATG等4種基元類型出現次數最低，分別為2、2、1、1次（圖3）。

2.4 分子標記開發及有效性驗證

由于多態性是判斷分子標記可用性的一個重要依據。為此，對所獲得的EST-SSR進一步分析，并從中選取了22個位點進行引物設計，共設計出22對引物（表4）。利用所設計的引物分別對來自不同地區的18個劍麻斑馬紋病菌進行了擴增評價。結果表明，只有9對引物從劍麻斑馬紋病菌DNA中擴增出條帶，占所開發總引物數的40.9%。具體而言，PP2F/R、PP7F/R、PP8F/R、PP11F/R、PP15F/R、PP16F/R、PP17F/R、PP19F/R、PP20F/R等9對引物能擴增出有效條帶（表4）。其中PP11F/R、PP16F/R、PP20F/R分子標記顯示出多態性，而PP20F/R多態性最為豐富（圖4）。總而言之，利用NCBI數據庫中的寄生疫霉菌EST數據來開發劍麻斑馬紋病菌SSR標記具有可行性，不過值得注意的是，存在一個轉移效率問題。

3 討論

斑馬紋病是劍麻最為嚴重的一種真菌病害。了解和監測劍麻斑馬紋病原菌的群體動態變化對于病害的防控具有重要意義。傳統上病害監測采用鑒別寄主法，但是該方法比較耗時費力。隨著分子生物技術的不斷發展，產生了多種分子標記技術，從而可以從分子水平上監測病原菌的變化。在這些分子標記技術中，其中SSR標記由于其具有分布廣、側翼序列相對保守、多態性豐富，標記多呈共現性，以及重復性好等優點而廣受歡迎。SSR標記開發綜合起來有如下3個途徑，一是基于基因組序列進行SSR位點發掘；二是利用同源或相關物種SSR信息而開發，通過驗證其真實性，從而到達開發SSR的目的；最后則是基于轉錄組數據庫信息進行SSR標記開發。本研究中，通過從NCBI中下載的10 525條寄生疫霉EST，經同源性比對分析后獲得的5 519條無冗余的Unigene，最后利用MISA軟件進行SSR發掘。結果篩選到1～6堿基SSR199個，分布在186條無冗余的EST上，出現頻率為10.6%。其中出現頻率由高到低依次為三核苷酸重復基元類型、二核苷酸重復基元類型、單核苷酸重復基元類型以及六堿核苷酸重復基元類型。這與已報道的構巢曲霉菌（Aspergillus niculans）排前三的SSR基元類型（依次為五核苷酸基元類型、六核苷酸、核苷酸類型）具有明顯差異[17]。在鑒定的楊樹銹菌（Melampsora larici-populina）EST-SSR中，三核苷酸重復基元的數量最多，占全部SSR 的44.70%，為優勢重復基序；其次為五核苷酸、四核苷酸、二核苷酸、所含微衛星所占比例分別20.53%、17.72%、17.05%[18]。由此揭示，不同病原菌菌體中SSR類型存在明顯差異。更進一步比較表明，SSR優勢重復基元類型也因病原菌的不同而存在著明顯差異。在本研究中，二核苷酸重復基元類型中，存在AC/GT、AG/CT與AT/AT等3種類型，其中AG/CT為優勢類型。而三核苷酸重復基元類型中共存在10種不同基序，其中AAG/CTT、AGC/CTG與AGG/CCT為優勢類型。與之相比，尖鐮孢（Fusarium oxysporum）EST-SSR以二核苷酸重復基元類型為主，占總SSR的59.78%。二核苷酸重復基元又以AC/GT（0.51%）為主[19]。

利用同源或相關物種SRR信息而開發標記，其轉移效率是評價引物開發成功的重要指標。為此，在本研究中利用NCBI數據庫中的煙草疫霉菌EST數據所合成的22對引物對18個劍麻斑馬紋病菌DNA進行了真實性評價。結果表明，僅9對引物能擴增出條帶，占總標記的40.9%。這表明其轉移效率為40.9%。相比之下，Zhu等[20]利用大豆疫霉EST序列數據，從中設計了40對SSR引物，結果有33對（82.5%）擴增出SSR特征條帶；隨后，藺宇等[4]設計140對EST-SSR引物，并通過用10個大豆疫霉分離物進行PCR 檢測，最終共有111引物（79.3%）擴增出SSR 特征條帶。而徐靜靜等則從1 234個含有2～4個堿基重復單元的完全SSR中選出260段設計引物，經10個大豆疫霉分離物基因組DNA檢測，有213對（81.9%）擴增出SSR特征條帶，其中114（53.5%）對引物擴增出多態性[5]。由此表明，通過不同EST數據來開發病原菌的分子標記，其效率具有明顯差異。就本研究而言，雖然所利用數據為寄生疫霉菌與引起劍麻斑馬紋病病原菌煙草疫霉（Phytophora nicotianae var. parasitica 或表示為Phytophora parasitica var. nicotianae）十分近源，但值得注意的是，即使是同一病原菌在與不同寄主共同進化過程中也可能產生變異[21]。另外，由于受內含子有無差異的影響，一些cDNA序列與相應基因組區域存在著一定差異，從而容易導致所發掘的EST-SSR位點序列不存在于基因組DNA上，繼而導致所開發的引物不能進行有效PCR擴增[22]。因此，EST-SSR位點的真實性是需要實驗進行驗證。

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