云南杓蘭菌根真菌組成及共生關系研究

安曼云

摘要： 杓蘭屬（Cypripedium）植物因具有較高的觀賞和藥用價值而長期被過度采集，已成為瀕危植物。利用菌根技術進行杓蘭屬植物的保護和人工栽培，需要獲得其可培養的菌根真菌。該研究采用分離培養法和共生回接方法，研究了云南杓蘭菌根真菌菌群組成及其共生關系。結果表明：（1）從10株云南杓蘭300塊毛根組織中分離獲得126株內生真菌，歸屬為3個菌屬，分別是膠膜菌屬（Tulasnella）73株、伏革菌屬（Corticium）36株、角擔菌屬（Ceratobasidium）17株。其中，膠膜菌屬為優勢菌群，占總菌株數量的57.94%。（2）6株供試菌株中，4株菌株可顯著縮短種子的萌發過程，6株菌株對幼苗的生長有顯著的促進作用。（3）從中篩選獲得一株CY18高效促生真菌，對云南杓蘭種子共生萌發和幼苗共生生長有極顯著的促進作用。該研究結果為更好地利用菌根技術進行杓蘭屬植物資源的保護與可持續利用奠定了基礎。

關鍵詞： 云南杓蘭， 菌根真菌， 優勢菌群， 膠膜菌屬

中圖分類號： Q948

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）06076305

Abstract： Cypripedium plants are endangered by overharvesting due to their high ornamental and medicinal value. It is necessary to obtain the culturable mycorrhizal fungi in the application of mycorrhizal technology for the protection and artificial cultivation of C. yunnanense. The composition of mycorrhizal fungi and their symbiotic relationship of C. yunnanense were studied by culturedependent and inoculate methods. The results showed that one hundred and twentysix independent fungal isolates were obtained from three hundred root tissues of C. yunnanense. The isolates were identified to three genera： Tulasnella （seventythree）， Corticium （thirtysix） and Ceratobasidium （seventeen）. Among them，Tulasnella （57.94%） were dominant genus. The mycorrhizal fungi could significantly shorten the seed germination process and promoted the seeding growth. The strain CY18 was found to be a growthpromoting fungus. Moreover， above results simultaneously could be used as a valuable candidate sources for the protection and sustainable utilization of C. plants resources by mycorrhizal technology.

Key words： Cypripedium yunnanense， mycorrhizal fungi， dominant gunes， Tulasnella

云南杓蘭（Cypripedium yunnanense）為蘭科（Orchidaceae）杓蘭屬地生型多年生植物，主要分布在滇西北高海拔的山坡上，其花色艷麗，極具觀賞和藥用價值（于永福，2004；陳麗飛等，2012）。近年來，杓蘭屬植物的野生種群數量急劇下降，已處于瀕危狀態，亟待保護（趙國英等，2013）。但是，由于杓蘭屬植物多數自花不育導致自然結實率較低，人工繁育過程中種子無胚乳難以萌發、幼苗生長緩慢、死亡率高等問題極大地限制了杓蘭的保育工作（楊穎婕，2016；鄭桂靈等，2013）。如何實現杓蘭屬植物資源的保護與再生，已成為重要而急切的課題。

菌根是自然界中一種普遍的共生現象，所有蘭科植物都與真菌共生形成蘭科菌根（Orchid Mycorrhizae， OM）（蓋雪鴿等，2014）。自然條件下，其種子萌發到開花結果的整個生活史對菌根真菌有絕對的依賴性（Dearnaley，2007）。蘭科植物種子僅有原胚，自身貯存的營養物質有限，自然條件下萌發困難，需依靠真菌的侵染提供營養才能萌發（鄭超文和肖婭萍，2014）。蘭科菌根的形成是通過種子和根的侵入兩條途徑（周玉杰等，2009）。Harley等（1983）首次證實杓蘭和真菌是互利共生的關系。Huynh et al（2009）研究發現杓蘭的不同生長階段與不同真菌類型共生。一些蘭科植物在萌發期所需要的真菌多樣性要比成年之后的需要更高（Bidartondo & Read，2008）。臧穆等（2004）研究發現黃花杓蘭的根際和根皮層細胞內具有不同階段的小型菌核。高倩等（2009）研究發現杓蘭屬植物菌根真菌的新近入侵、開始被消解、消解后的殘余及消解后的物質4個階段在杓蘭的生活周期中周而復始地進行。趙欣宇等（2014）、權嬌嬌等（2015）和繆福俊等（2015）研究發現杓蘭屬植物根部存在豐富多樣的真菌類型。鄧蓮等（2012）通過培養基優化及添加激素能使大花杓蘭種子獲得無菌萌發。黃家林和胡虹（2002）也通過培養基、激素和種子預處理后使黃花杓蘭的種子無菌萌發。杓蘭屬植物與真菌存在較強的互作規律，菌根系統中存在多種內生真菌類型，其種子都能實現無菌萌發，但萌發進程相當緩慢，對于杓蘭屬植物種子和幼苗的無菌和不同真菌類型共生的效果對比方面研究的報道較少。本研究通過對云南杓蘭不同內生真菌菌群、野外授粉、種子采集及活力檢測、種子共生萌發、幼苗共生等進行系統研究，首次分析云南杓蘭種子共生萌發和無菌萌發的進程階段，掌握野生云南杓蘭不同內生真菌類型對種子和幼苗的共生促進效果，旨在為深入研究杓蘭與內生真菌的共生關系提供可利用的菌種資源，為杓蘭屬植物的保育提供理論依據。

1材料與方法

1.1 采樣地概況及樣品采集

采樣地位于云南省香格里拉縣納帕村（99°37′56″ N，27°51′34″ E，海拔3 303 m）。云南杓蘭生于林緣，樣地中分布數量每100 m2為23株，為腐殖質土壤生境。云南杓蘭毛根采集：2015年6月20日隨機選取30株，每株根分布的不同方向選取10個毛根段（3～5 cm），放入冰盒；云南杓蘭種子采集：2015年10月25日采集蒴果，經表面滅菌后用脫脂棉將其密封在無菌的小瓶中。將樣品帶回實驗室置于4 ℃冰箱保存。

1.2 云南杓蘭菌根真菌分離與純化

采用組織塊分離方法，以馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養基進行真菌的分離與純化。PDA培養基的配方及制作：馬鈴薯200 g，洗凈后去皮切成小塊，開水煮30 min，紗布過濾后取濾液加入葡萄糖20 g，瓊脂15 g，加熱至完全溶解，蒸餾水定容1 L，121 ℃滅菌20 min。

將云南杓蘭毛根段切成1 cm的小段后進行消毒（70%酒精浸泡30 s，再用2%次氯酸鈉浸泡消毒3～5 min，無菌水沖洗3～5次）。用無菌濾紙吸干水分后切成5 mm小塊，接種含有硫酸鏈霉素（50 mg·L1）的PDA培養基中。每皿9塊，重復3次。并對分離的真菌進行DNA提取和ITS擴增測序，將測序結果進行Blast比對分析，對真菌進行初步的分類。

分離頻率（%）=a/b×100

式中，a為分離到的某一指定類型真菌的菌株數量，b為分離的真菌菌株數量。

分離率（%）=a/b×100

式中，a為分離到的某一指定類型真菌的菌株數量，b為分離樣品組織塊總數。

1.3 云南杓蘭種子活性檢測

采用TTC（Triphenyl tetrazolium chloride）染色法檢測云南杓蘭種子活性，在顯微鏡下統計有胚種子數目和染色數目，染成紅色或淺紅色代表有活力的種子。

種子胚活力%=有活力種子數/有胚種子數×100%

1.4 云南杓蘭種子萌發試驗

無菌萌發試驗： 將云南杓蘭種子溶于無菌水中制備成懸浮液，取等量的種子懸浮液（200 μL）均勻地散布在改良過的Harvais培養基 （去除NH4NO3，

添加甘氨酸、谷氨酸、KT、BA激素等），3瓶一組，3次重復。以不做預處理（種子不在NaClO溶液中浸泡，培養基用Harvais，不加激素）做對照，3瓶。

共生萌發試驗：取等量的種子懸浮液（200 μL）均勻地散布在Harvais培養基上。觀察1周，去除有污染的三角瓶。從分離得到的每個菌屬中選取2株菌株作為供試菌株，共6株。6株供試菌株的菌塊（0.5 cm × 0.5 cm）分別放入三角瓶中，每種菌做3個重復，以不接菌的6瓶做對照組，培養觀察。

萌發率=萌發種子數/（播種數 × 有胚率） × 100%

1.5 云南杓蘭幼苗共生生長試驗

選取已培養好的云南杓蘭無菌幼苗（由云南省林業科學院組培室提供）進行挑選并準確稱量后移入到三角瓶中（采用Harvais培養基），每瓶6株。觀察一周后，去除有污染的瓶，分別接入6株供試菌株的菌塊（1 cm × 1 cm），每個菌株做3個瓶的重復。以不接菌的10瓶作為對照實驗。每10 d進行生長情況觀察，60 d后進行生物量相關數據測定。

鮮重增長率=（接種60 d后的重量-初始重量）/初始重量×100%。

全氮含量：H2SO4H2O2蒸餾法；全磷含量：H2SO4H2O2消煮鉬銻抗比色法；全鉀含量：H2SO4H2O2消煮火焰光度計法。

2結果與分析

2.1 云南杓蘭菌根真菌菌群組成分析

如表1所示，云南杓蘭的毛根中分離獲得多種真菌，共分離獲得126株，經ITS測序結果與GenBank中比對分析，將其初步歸屬至3個菌屬。其中，分離率最高的為膠膜菌屬，共有73株、分離率最少的為角擔菌屬，共有17株。3個菌屬中膠膜菌屬為優勢菌群，分離頻率高達57.94%。

2.2 云南杓蘭種子活力分析

云南杓蘭在野外自然授粉條件下結實率很低，僅3.33%。經人工授粉后其結實率顯著提高，為46.67%，并收集蒴果后進行了種子活力分析。由表2

可知，云南杓蘭種子有胚率為91.33%，發育較好，種子完全成熟。經過TCC法檢測，云南杓蘭種子胚活力為53.66%，滿足后期種子萌發實驗要求。

2.3 云南杓蘭種子預處理和真菌共生對其萌發的影響

云南杓蘭種子在不經任何預處理的情況下，其種皮開始慢慢皺縮，不能成功萌發。然而，在經過種子預處理及培養基優化后，促進了種子萌發，其萌發率為18.05%。由表3可知，6株供試菌株中，能促進云南杓蘭種子萌發的有4株，并對其促進效果不同。其中，菌株CY18對云南杓蘭種子的萌發具有較強的共生促進萌發效果。

為了進一步研究菌根真菌和種子預處理兩種方法對種子萌發的促生效果，將供試菌株回接和種子預處理后萌發階段進行了對比分析，結果見圖1。回接菌株后可顯著提高種子的萌發進程，不同菌株的共生萌發促進效果不同。4株菌株中，CY18菌株表現出較強的共生萌發效果，在第10周時，種子開始出現葉原基，而預處理無菌的種子還處于未萌發狀態，第15周時促使第一片葉子長出。表明云南杓蘭的種子萌發對菌根真菌具有較高的依賴性。該菌株有希望成為蘭科繁殖的促進種子萌發的真菌。

2.4 菌根真菌對云南杓蘭幼苗的促生效果分析

6株供試菌株過回接培養后，均能與云南杓蘭幼苗形成共生體系，且在其根內檢測到相應的菌株。如表1所示，6株菌株均不同程度的促進了云南杓蘭幼苗的鮮重增長率，不同的菌株表現出的促生效果不同。其中，能顯著促進幼苗生長為膠膜菌屬的2株（CY18和CY2），鮮重增長率和N、P、K含量分別顯著高于對照。3個菌屬對云南杓蘭幼苗的促生效果大小依次為膠膜菌屬>伏革菌屬>角擔菌屬。從6株供試菌株中篩選得到一株高效促生菌株CY18。

3討論

本研究采用組織塊分離法對云南杓蘭毛根中內生真菌進行了分離，其毛根系統中存在豐富多樣的真菌類型，涉及3個菌屬的真菌，均與幼苗建立共生體系。目前研究已知，與蘭科植物形成共生的主要真菌類型約有10個屬（蓋雪鴿等，2014）。本研究獲得的3個菌屬在蘭科其它植物菌根中已報道，屬擔子菌亞門，菌株數量在屬水平上高于前人。膠膜菌屬是蘭科植物的常見菌群和優勢菌群（繆福俊等，2015），本研究也證實了膠膜菌屬在上個菌屬中分離頻率最高，推斷膠膜菌屬菌根真菌對云南杓蘭可能具有一定的寄主專一性。

蘭科植物種子的萌發必須借助于菌根真菌為其提供營養才能萌發。那么是否真菌在蘭科植物種子萌發時的作用能被其它物質代替呢？相關研究表明在培養基中添加一些營養物質可促進種子的無菌萌發（鄧蓮等，2012；黃家林和胡虹，2001）。因此可能認為真菌在蘭科植物的種子萌發時并不是必需的。于是前人做了大量研究工作，發現真菌共生萌發可顯著提高萌發率（鄧蓮2012）。菌根真菌侵染種子后，與其建立共生關系，把胚和基質連接起來，菌絲為胚發育提供養分、水分等物質（Liu et al，2010）。本研究首次發現不同類型的內生真菌不但可以顯著提高云南杓蘭種子的萌發率，還可顯著縮短種子的萌發進程，在改良的培養基中無菌萌發的云南杓蘭種子萌發進程極其緩慢，需半年至一年多時間。

本研究6株供試菌株中，均能促進和云南杓蘭幼苗形成共生體系，不同程度地促進幼苗生長。但只有4株菌株能促進種子萌發，說明種子萌發對菌根真菌種群有特殊選擇，而幼苗階段開始，可與多種真菌建立共生關系，表現出更強的適應性。范黎（1994）研究推測，杓蘭屬植物生長的不同階段所需的真菌類型可能不一樣，而本研究證實了這一推測。在供試的6株菌根真菌中，CY18和CY2表現出較強的共生萌發及幼苗促生效果，且相比其它菌屬真菌，培養這2株膠膜菌屬的菌株時其生長速度較快，有希望成為杓蘭屬植物種子萌發和幼苗生長的高效促生菌，其促生機理仍待深入研究。

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