白芷種子蛋白質提取方法的比較

吳萍 郭俊霞 李青苗 夏燕莉 張美 肖特 方清茂

摘要 [目的] 建立適用于白芷種子的SDS-PAGE蛋白質樣品提取方法。[方法]比較5種提取方法所獲得白芷種子總蛋白質產量以及SDS-PAGE電泳的譜帶數目、強度和電泳分辨率等方面的差異。[結果] 方法a所提蛋白質含量高，雜質少，電泳譜帶清晰；方法b所提蛋白質溶液電泳譜帶清晰，分辨率較高，但提取含量較低；方法c和d所提蛋白質雜質較多，純度不高，分辨率較低；方法e所提蛋白質純度較高，但蛋白條帶缺失較多。[結論]方法a提取白芷種子蛋白質的效果最好，所提蛋白效率較高，雜質少，電泳譜帶清晰，分辨率高，譜帶數多，優于其他提取法。

關鍵詞 白芷種子；蛋白質提取；聚丙烯酰氨凝膠電泳

中圖分類號 S567.1+9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）06-0118-03

Comparison of Protein Extraction Methods for Angelica dahurica Seeds

WU Ping， GUO Jun-xia， LI Qing-miao et al （Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine Sciences， Chengdu， Sichuan 610041）

Abstract [Objective] To establish a suitable protein extraction protocol for total proteins extraction from Angelica dahurica seeds. [Method] We compared the total protein yield and SDS-PAGE electrophoretic band number and strength， lectrophoresis resolution by five different methods. [Result] Method a had higher protein content， less impurity and clearer electrophoresis band. Method b had clearer electrophoresis band， higher resolution， but lower protein content. Methods c and d had more impurity， lower purity and resolution. Method e had higher protein purity， but more lack of protein bands. [Conclusion] Method a has the best extraction effects of protein from A. dahurica seeds， which has higher protein extraction efficiency， less impurity， clearer band， higher resolution， more band number. Thus， method a is superior to other four methods.

Key words Angelica dahurica seed；Protein extraction；Polyacrylamide gel electrophoresis

種子是遺傳因素的載體之一。受遺傳基因控制的蛋白質分子普遍存在于種子內，并在植物的生長發育過程中起著重要作用[1]。種子蛋白是基因表達的產物，能在種子內積累到很大量而不降解，其電泳譜帶具有高度穩定性、專一性和疊加性，在植物的生長發育過程中起著重要作用[2]。種子蛋白作為一種遺傳標記被越來越多地應用于種、屬關系，種間或種內遺傳多樣性分析，品種鑒定、物種起源及植物種質資源的研究[3]。1991年，國際種子檢驗協會將蛋白質電泳方法正式定為標準的品種鑒定方法，并納入種子檢驗規程[4]。目前，蛋白質電泳技術已廣泛應用于農作物、蔬菜、牧草等種子的品種鑒定[5]、純度測定[6]、親緣關系分析[7]。但藥用植物種子的蛋白質電泳研究報道甚少，而關于白芷種子蛋白質電泳的研究鮮有報道。

白芷為傘形科植物白芷[Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook.f]或杭白芷[Angelica dahurica（Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook. f. var. formosana （Boiss.） Shan et Yuan]的干燥根，因初生根桿為芷，色白，故名白芷，以根入藥，其性溫，氣芳香，味辛、微苦，歸胃、結腸、肺經，具有散風除濕、通竅鎮痛、消腫排膿等功效[8]，可藥食兩用。白芷以種子繁殖為主，多采用育苗移栽，在常規保存手段下，隔年陳種子發芽率不高，而制約種子發芽率的原因尚不清楚。細胞或組織中受體分子、信號分子等參與基因表達調控，即基因調控均需要蛋白質的參與[9]，陳年白芷種子發芽率降低也是基因表達調控的結果。蛋白質提取是電泳

的第1步，蛋白質樣品制備的好壞直接決定結果的成敗。筆者以白芷種子為材料，采用5種蛋白質提取方法進行比較分析，以期優化出一套適于白芷種子的蛋白質提取方法，為探索白芷種子衰老等理論機制的研究提供技術平臺。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試白芷（Angelica dahurica）種子來源于遂寧市永興鎮中脊村，2015年采收。

1.2 主要儀器與試劑

Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽、PowerPacTM HC高電流電泳儀購自美國Bio-rad伯樂公司；Heraeus Multifuge X3低溫離心機購自美國Thermo公司；甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸鈉（SDS）、尿素、硫脲、3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內鹽（CHAPS）、三氯乙酸（TCA）、β-巰基乙醇（2-ME）、TEMED、過硫酸銨均購自Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質提取。

方法a：取種子粉碎，過40目篩，稱0.1 g 于離心管中，加入2 mL預冷的提取液A （7 mol/L尿素，2 mol/L 硫脲，4% CHAPS，40 mmol/L Tris-base， 2% 2-ME），混懸后冰上靜置3～4 h，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，上清液置于-80 ℃冰箱中備用。

方法b：取種子粉碎，過40目篩，稱0.1 g于離心管中，加入預冷的提取液B（100 mmol/L HEPES， pH 7.5， 5 mmol/L EDTA， 5 mmol/L EGTA， 10 mmol/L Na3VO4， 10 mmol/L NaF， 5% 甘油， 2% 2-ME） 2 mL，混懸后冰上靜置3～4 h，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，上清液置于-80 ℃冰箱中備用。

方法c：取種子粉碎，過40目篩，稱0.1 g于離心管中，加入2 mL預冷的提取液C（150 mmol/L Tris-HCl， pH 8.0， 25% 甘油，2% 2-ME），混懸后冰上靜置3～4 h，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，上清液置于-80 ℃冰箱中備用。

方法d：取種子粉碎，過40目篩，稱0.1 g于離心管中，加入稀釋8倍的濃縮膠緩沖液2 mL [含4.95%丙烯酰胺混合液（29∶1），12.5% 0.5 mol/L Tris-HCl，pH 6.8，0.1% SDS，0.1% 過硫酸銨，1% TEMED]，冰浴30 min后，60 ℃水浴40 min，冷卻，10 000 r/min離心15 min取上清，-80 ℃冰箱中備用。

方法e：每份材料取研磨后過40目篩的種子粉末0.1 g于離心管中，加入2 mL樣品提取液E （50 mmol/L Tris-HCl， pH 6.8，2%SDS，5% 2-ME，10%甘油，0.1%溴酚蘭），混勻，室溫放置1～2 h。10 000 r/min離心10 min，取上清液進行電泳，-80 ℃冰箱中備用。上樣時100 ℃沸水加熱4 min 后進行。

1.3.2 紫外分析儀定量測定蛋白質含量。以牛血清白蛋白為標準蛋白，采用紫外分析儀定量測定上述樣品的蛋白質含量。

1.3.3 聚丙烯酰氨凝膠電泳。

采用SDS-PAGE法，分離膠12%，濃縮膠5%，垂直平板電泳，加樣量為10 μL。電泳緩沖液為Tris-Gly（pH 8.3）系統，起始電壓75 V，在指示劑進入分離膠后改為150 V，恒壓電泳，待指示劑至膠板下沿1 cm左右停止電泳。

1.3.4 染色與脫色。

膠剝離后放入加有R250染色液的染色皿中，染液漫過膠即可，置于搖床上，轉速約為45 r/min，時間約1 h，完成后染液倒去并用水洗去染液。取出染色過的膠放于加有脫色液的染缸里，脫色液漫過膠即可，置于搖床上，轉速約為45 r/min，本底色脫凈，條帶清晰可見即可，完成后倒掉脫色液。

1.3.5 圖譜分析。用Quantity one軟件進行拍照并做圖像分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白質產量的比較

蛋白質產量和純度是評價提取方法的重要指標。產量越高，蛋白質提取越完全。蛋白質純度不同，對電泳的影響也不同，較多的雜質將嚴重影響電泳結果。因此，蛋白質產量越高，純度越好，提取方法越好。

由圖1可知，提取方法a、b、c、d、e的蛋白質含量測定結果分別為93.2，52.5，66.4，90.3，40.6 mg/g。其中，方法a所提的蛋白質含量最高，為93.2 mg/g，方法e所提的蛋白質含量最低，為40.5 mg/g，極差為52.7 mg/g。

2.2 電泳結果比較

圖2為5種白芷種子蛋白質提取方法的SDS-PAGE電泳圖譜。結果顯示，不同的提取方法所得的PAGE圖譜各異，存在條帶數目、強度、清晰度等方面的差異。泳道A譜帶較全且清晰；泳道B譜帶高分子量蛋白質有缺失，條帶較弱；泳道C、D、E譜帶缺失較多，其中泳道C出現紋理狀，樣品中雜質較多；泳道D條帶模糊且背景較深，拖尾嚴重，可能是由于樣品中雜質和不溶性蛋白質較多；泳道E條帶較弱，蛋白質缺失嚴重。

由表1可知，白芷種子的SDS-PAGE電泳圖譜共有15條譜帶，均為中、低分子量蛋白質，主要集中在14.4～66.2 kD。方法a譜帶數目最多為14條，其次是方法b有11條，方法c有6條，而方法d和e均僅有4條。不同泳道譜帶的分子量見圖3。結果顯示，方法a提取的蛋白質（泳道A）種類較多，提取效率較高，這與蛋白質產量的分析結果一致。

3 結論與討論

種子保存的核心問題是如何控制種子的生命力[10]。蛋白質在種子抗衰老過程中作用很大，貯藏過程中蛋白質分解是種子老化乃至活力喪失的明顯特征及原因[11]。種子活力在基因水平上的差異也是通過基因表達的產物蛋白體現出來的。聚丙烯酰胺凝膠電泳是常用研究蛋白質表達的方法之一，具有設備簡單、操作方便和分辨率高等優點。蛋白質樣品的提取是電泳的第一步，直接決定結果的成敗。該研究針對白芷種子蛋白質樣品制備設計5種方法，通過蛋白質產量及電泳結果的分析，得出方法a更適合于白芷種子蛋白質的制備，可能是因為方法a中蛋白質提取液含有尿素和硫脲，兩者發揮協同作用增強了蛋白質的溶解，甚至可以溶解一些非水溶的貯藏蛋白質。

蛋白質產量和純度是評價提取方法的重要指標[1]。該研究以白芷種子為材料，選取5種不同的蛋白質提取方法進行比較分析。結果顯示，方法a和d所提蛋白質含量明顯高于其他3種提取方法。其中，方法d提取的蛋白質溶液，電泳譜帶背景較深，雜質較多，分辨率較低；而方法a和b所提蛋白質溶液，電泳譜帶清晰，分辨率較高；雖然方法a所提蛋白質溶液的電泳譜帶在部分條帶出現高豐度蛋白質，致使譜帶展寬，但對電泳的分辨率影響不大。方法c雖然所提蛋白質含量高于方法b和e，但雜質較多，提取純度較低，影響電泳的分辨率。方法e雖然所提蛋白質純度較高，但蛋白質損失嚴重，蛋白質條帶缺失較多。因此，綜合各方面情況，方法a提取白芷種子蛋白質的效果最好，其提取效率高，雜質少，電泳譜帶清晰，分辨率高，譜帶數多。

參考文獻

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