基于灰色關聯的苗藥紅禾麻總黃酮含量影響因子分析

鄒淑涵 陳胤睿 徐文芬 黃仕清 趙麗婷 齊維娜

摘 要：采用AlCl3比色法對苗藥紅禾麻42個居群中的總黃酮含量進行分析測定，并用土壤養分測定儀測定對應產地土壤中的銨態氮、速效磷、有效鉀、pH值和水分，通過向距產地較近的氣象部門查詢和以全球衛星定位系統GPS、海拔表等測定地理氣候因子，結合42個居群紅禾麻ISSR遺傳多樣性分析結果，運用灰色關聯度分析法對紅禾麻不同種質資源藥材中總黃酮的含量與各影響因子進行相關性分析。結果表明：42個紅禾麻不同種質資源藥材總黃酮含量為0.42%～2.16%，平均加樣回收率為97.86%，RSD為1.5%；環境因子和遺傳因子中與總黃酮含量關聯度較大的因素分別為無霜期和Shannon信息指數I，而各影響因子與總黃酮含量的關聯度中，以Shannon信息指數I（r = 1.03）最大，土壤pH（r = 0.49）最小，表明遺傳因子對紅禾麻藥材總黃酮含量的影響大于環境因子。該研究結果為紅禾麻藥材優良種質資源篩選及野生變家種研究提供了依據。

關鍵詞：紅禾麻種質資源， 總黃酮， 遺傳因子， 環境因子， 灰色關聯度分析

中圖分類號：Q945

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2017）04-0461-10

Abstract：The total flavonoids content of 42 groups of Guizhou miao medicine Laportea bulbifera were analyzed and determinated by AlCl3 colorimetric. The ammonium nitrogen， available phosphorus， available potassium， pH and water were determinated in the soil by soil nutrients tester and the origin of geographical climatic factors of L. bulbifera from different producing areas were consulted. In order to analyze the total flavonoids contents of different germplasm resources and impact factors by grey correlation degree analysis， geographical climate factors were determinated by the closed meteorogical department who had been inquired data and GPS， combined with the ISSR results of genetic diversity of 42 groups with the above measured data. The result revealed that the flavonoid contents of L. bulbifera in 42 groups of different germplasm resources was at 0.42%-2.16%， the average recovery rate was 97.86% and RSD was 1.5%， respectively. Frostfree period and the Shannon information index I were the biggest factors with the flavonoid contents in the environment factors and genetic factors. And the biggest correlation degree was Shannon information index I（r=1.03） and the smallest was the soil pH（r=0.49） in all of correlation degrees. It could be judged that genetic factor had more influence on the quality of medicinal materials L. bulbifera than environmental factor. The results provide the reference for choosing good germplasm resources and change the wild to the domestic.

Key words：Laportea bulbifera germplasm resources， total flavonoids， genetic factors，environmental factors， grey correlation degree analysis

紅禾麻系蕁麻科（Urticaceae）艾麻屬（Laportea）植物珠芽艾麻 （L. bulbifera）的新鮮或干燥全草，又名紅合麻（國家中醫藥管理局，2005）。紅禾麻為貴州重要的苗族藥物，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》中（貴州省藥品監督管理局，2003），苗藥名為Uabdetdend 蛙斗等，性味辛、溫，有小毒，歸肝、脾、胃經，具有祛風除濕，活血化瘀之功效，用于治療風濕麻木，跌撲損傷，骨折等疾病（羅迎春和孫慶文，2013）。該藥材為貴州同濟堂有限公司民族藥“潤燥止癢膠囊”的主要原料藥材，對治療老年血虛引起的皮膚瘙癢有獨特療效，市場競爭力較強。一直以來，紅禾麻的原材料供給主要依靠采挖野生資源，隨著市場需求量逐年增加，野生資源逐年銳減，藥材質量良莠不齊，已不能滿足生產需要，目前亟需篩選優良紅禾麻種質資源進行野生馴化研究。

種質資源是提高中藥材質量的關鍵和源頭，種質的優劣對中藥材的產量和質量有決定性的作用，是進行中藥材規范化基地建設的先決條件。紅禾麻種質資源藥材質量是由不同生境中的某種環境因子造成，還是不同居群的遺傳背景不同造成？它們與環境因子或遺傳背景之間是否存在某些關聯？這對篩選紅禾麻優良種源非常重要。通過查閱國內外相關文獻對紅禾麻的研究報道，紅禾麻主要含有黃酮類和香豆素類化合物，黃酮類具有較強抗氧化活性（Mincheol et al，2003），香豆素類具有較好的鎮痛抗炎和免疫抑制作用（向明等，2006，2009；蘇志強等，2009；侯文睿等，2010；馬琳等，2012）。因此，本文采用比色法，以總黃酮為測定指標，建立含量測定方法，分析測定紅禾麻不同種質資源藥材中總黃酮含量，并與對應種源ISSR遺傳多樣性分析結果（內因）和環境因素（外因），通過灰色關聯度分析紅禾麻不同種質資源藥材總黃酮含量與各影響因子的關聯度，探討內因和外因對紅禾麻藥材總黃酮含量的影響，為紅禾麻藥材優良種質資源篩選及相關產業的可持續發展提供前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

UV1800紫外—可見分光光度計（日本島津公司）；TPY-6型土壤測試儀（浙江托普儀器儀有限公司）；etrex venture手持GPS基準定位儀（中國臺灣）等。蘆丁對照品（購于中國食品藥品檢定研究院，批號100080-200707，供UV測定的含量為92.5%），三氯化鋁、甲醇、乙醇等其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

所有供試樣品均為課題組于各分布點采集，經貴陽中醫學院孫慶文教授鑒定為蕁麻科艾麻屬植物珠芽艾麻（L. bulbifera）的地上部分，憑證標本存放于貴陽中醫學院生藥實驗室。同時以深度約20 cm、對角線布點采集相應產地土壤。藥材置于40 ℃鼓風干燥，粉碎過3號篩，置干燥器中備測。土壤樣品自然風干，粉碎過2號篩，置干燥器中。藥材樣品信息詳見表1，土壤樣品信息詳見表2。

1.2 紅禾麻不同種質資源藥材中總黃酮含量測定方法的建立

1.2.1 對照品溶液及顯色劑制備 精密稱取蘆丁對照品30.80 mg，置于100 mL的容量瓶中，加70%乙醇溶解制成0.284 9 mg·mL-1蘆丁對照品溶液。稱取AlCl3 25 g，加水溶解，制成10% AlCl3溶液，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末約1 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定重量， 置于水浴中加熱回流1 h， 放冷至室溫，再稱定重量，用70%乙醇補足減失重量，搖勻，過濾，精密量取續濾液10 mL，分別等量加入石油醚（30～60 ℃）萃取4～5次，至石油醚層無明顯變化后，取下層萃取液，即得供試品溶液，精密量取該溶液0.5 mL，按照標準曲線的繪制方法，自“加入10%AlCl3”起，依法測定其吸光度值。

1.2.3 標準曲線繪制 分別精密吸取“1.2.1”下蘆丁對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL的容量瓶中，各加入10% AlCl3溶液2 mL，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得一系列濃度的蘆丁對照品溶液，于40 ℃水浴中顯色反應30 min，取出，搖勻，以相應試劑為空白，于406 nm波長處分別測定其吸光度，以蘆丁對照品溶液的濃度為橫坐標，對應的吸光度值為縱坐標，計算其回歸方程。

1.2.4 樣品測定 分別稱取42個不同種質資源紅禾麻藥材樣品粉末約1 g，精密稱定，分別按“1.2.2”項下的方法制備供試品溶液，依照標準曲線項下方法，自“加入10%AlCl3”起，依法測定其吸光度值，將測得的吸光度值代入上述回歸方程，分別計算其以蘆丁計總黃酮的含量。

1.3 紅禾麻不同種質資源產地的環境因子采集及測定

1.3.1 地理氣候因子的采集及查詢 采用手持GPS基準定位儀，測定紅禾麻不同種質資源產地的海拔、經度及緯度，并通過當地氣象部門查詢氣象資料，獲取年平均溫度、7月平均溫度、年均降水量、年均日照時數以及無霜期等數據。

1.3.2 土壤養分測定 采用土壤養分速測儀，測定42個居群紅禾麻產地土壤樣品中銨態氮、速效磷、有效鉀的含量以pH值；依照《中國藥典》2015年版四部0832水分測定第二法（ 烘干法）測定其水分含量（國家藥典委員會，2015）。

1.4 紅禾麻不同種質資源遺傳多樣性測定分析

1.4.1 總DNA的提取及ISSR引物的合成與篩選 采用CTAB法提取紅禾麻總DNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢驗DNA質量，核酸定量分析儀檢測DNA純度， -20 ℃保存備用。ISSR引物設計參照加拿大哥倫比亞大學公布的序列（No.801-900），由上海生工生物工程股份有限公司合成。從70條ISSR引物中篩選出10條多態性好，條帶分布均勻，清晰易辨的引物來擴增。

1.4.2 PCR擴增與產物檢測及數據分析 反應體系為25 μL的體系中包含模板DNA 1 μL，2×Taq PCR MasterMix 13 μL，引物（10 μmol·L-1）1 μL，用滅菌超純水補至25 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；52～58.2 ℃退火45 s；72 ℃延伸1.5 min，40次循環；72 ℃后延伸7 min。PCR產物7 μL于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳1.0 h左右， 溴化乙錠染色，在凝膠成像系統下觀察拍照。同一引物擴增的電泳遷移率一致的條帶有帶記為“1”，無帶記為“0”，形成0/1矩陣。采用Popgene 32軟件計算42個居群紅禾麻的多態位點、多態性位點百分率（PPL）、Neis遺傳多樣性指數（H）、Shannons多態性信息指數（I）、遺傳分化系數（Gst）和基因流（Nm），分析其遺傳多樣性水平。

1.5 紅禾麻總黃酮含量與影響因子的灰色關聯度分析

灰色關聯度分析法，是對一個動態變化系統發展態勢的量化比較。本研究以42批紅禾麻藥材中總黃酮含量作為母序列，對應產地的環境因子（外因）及遺傳因子（內因）為子序列，先對原始數據進行標準化，根據下述公式計算出紅禾麻藥材中總黃酮含量與各影響因子的灰色關聯系數。其中，分辨系數ρ為0.5。

再根據下述公式計算灰色關聯度：

2 結果與分析

2.1 紅禾麻種質資源藥材中總黃酮含量測定結果

實驗結果顯示，標準曲線繪制，計算得回歸方程和相關系數為A=28.03C+0.028 3，r=0.999 5，表明蘆丁對照品溶液濃度在5.698～28.49 μg·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系。其方法學考察結果：精密度，計算相應蘆丁對照品溶液吸光度值的RSD值為0.15%，表明儀器的精密度良好；重復性，計算以蘆丁計總黃酮含量的RSD值為1.1%，表明本法測定的重復性良好；穩定性，計算相應供試品溶液吸光度值的RSD值為0.19%，表明供試品溶液顯色在60 min內基本穩定；加樣回收率，計算以蘆丁計總黃酮含量的平均回收率為97.86%，RSD值為1.5%，表明該方法測定的準確度較高。42個紅禾麻種質資源藥材中總黃酮含量為0.42%～2.16%，含量差異較大（表3）。

2.2 紅禾麻不同種質資源產地的環境因子采集及測定結果

紅禾麻種質資源不同產地地理氣候因子數據見表1，土壤樣品中銨態氮、速效磷、有效鉀、土壤pH值及水分含量結果見表2。

2.3 紅禾麻不同種質資源的ISSR遺傳多樣性分析結果

多態性位點數（PPB）、多態位點百分率（PPL，%）、等位基因數Na、有效等位基因數Ne、Neis基因多樣性H、Shannon信息指數I等6個指標均可用于評價遺傳多樣性水平，它們的值越大，說明遺傳多樣性水平越高（表4）。

2.4 紅禾麻總黃酮含量與環境因子及遺傳因子的灰色關聯度分析

紅禾麻藥材中總黃酮含量與各影響因子的灰色關聯度結果見表5。表5結果顯示，各影響因子對紅禾麻藥材中總黃酮含量影響為Shannon信息指數I（r=1.03）>經度（r=0.97）>無霜期（r=0.95）>Neis指數H（r=0.91）> 7月均溫（r=0.84）>年均氣溫（r=0.82）>土壤有效鉀（r=0.81）>土壤銨態氮（r=0.77）>年均日照數（r=0.75）>土壤水分（r=0.72）>土壤速效磷（r=0.71）>年均降水量（r=0.69）>海拔（r=0.64）>緯度（r=0.63）>土壤pH值（r=0.49），環境因子中無霜期和經度與總黃酮含量關聯度較大，其中總黃酮含量較高的產地貴州省赫章縣羅布石林（8號居群）、貴州省梵凈山蘑菇石（22號居群）、貴州省梵凈山拜佛臺（24號居群）、貴州省松桃縣烏羅鎮（29號居群），這四個產地經度較大無霜期較長，研究結果提示可以通過大棚培育調整無霜期天數以增加有效成分積累，可提高紅禾麻藥材總黃酮含量。而在所以影響因子中Shannon信息指數I和Neis指數H與紅禾麻總黃酮含量關聯度最大，表明遺傳因子是影響紅禾麻藥材總黃酮含量的主導因子，結果顯示Shannon信息指數I和Neis指數H越大，即遺傳多樣性水平越高的居群，總黃酮平均含量較大，如：居群貴州省赫章縣羅布石林（4號居群）、貴州省赫章縣羅布石林（8號居群）、貴州省赫章縣韭菜坪（9號居群）、貴州省梵凈山拜佛臺（24號居群）遺傳多樣性水平較高（Shannon信息指數I （0.302 8～0.441 9），而其總黃酮含量也較高（1.43%～2.16%）。

3 討論

灰色關聯度分析是一種根據因素間發展趨勢的相似或相異程度，利用各子因素間的數值關系對一個動態變化的系統進行量化分析的方法。該方法簡單易行，克服了回歸、相關性等分析方法的局限性。李倩等（2010）運用灰色關聯度分析法確定了影響丹參品質的主導氣候因子，王宗權等（2010）運用灰色關聯度分析法確定了影響黃芪3種皂苷成分的主導環境因子分別為年均氣溫和平均無霜期， 蔡萍等（2014）運用灰色關聯度法分析影響杜仲中4種有效成分含量產地差異的主要環境因子。本研究運用灰色關聯度分析法，以紅禾麻不同種質資源藥材中總黃酮含量作為母因素，以各環境因子和評價遺傳多樣性水平的指數作為子因素進行分析，通過對苗藥紅禾麻種質資源42個地理居群的各影響因子與總黃酮含量變化的分析，Shannon信息指數I、Neis指數H、經度、無霜期4個影響因子的關聯度較大（>0.90），其中Neis指數H關聯度最大，表明各影響因子中內因（遺傳因子）對紅禾麻藥材總黃酮含量影響最大，因此選擇遺傳變異較小的優良種質資源，能夠更好地控制藥材品質，其中貴州赫章縣羅布石林（4、8號居群），貴州赫章縣韭菜坪（9號），貴州梵凈山拜佛臺（24號居群）4個居群的遺傳多樣性指數和總黃酮含量較高，不僅可以作為人工育種的選育材料，而且對于苗藥紅禾麻種植適生地區劃研究有很好的參考價值。

本研究所建立的紅禾麻藥材總黃酮含量測定方法簡便快速、準確可行，可作為苗藥紅禾麻藥材的質量控制方法，為《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》（2003年版）收載的紅禾麻藥材質量標準提升奠定一定的實驗基礎。

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