羅氏沼蝦TLRs基因表達(dá)差異分析

劉偉利　劉紅　丁福江　戴習(xí)林

摘要：【目的】探究羅氏沼蝦Toll樣受體（TLRs）基因（MrToll1、MrToll2和MrToll3）在不同組織中及感染溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）后不同時(shí)間鰓組織的表達(dá)量差異變化，為揭示羅氏沼蝦TLRs在應(yīng)對(duì)病害等免疫方面的表現(xiàn)和作用機(jī)理提供參考依據(jù)?！痉椒ā坷脤?shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分別檢測(cè)MrToll1、MrToll2和MrToll3基因在羅氏沼蝦肌肉、鰓、肝胰腺、心臟、胃、腸、血淋巴、神經(jīng)節(jié)、眼柄等不同組織中的相對(duì)表達(dá)量，并以同樣方法檢測(cè)羅氏沼蝦感染溶藻弧菌后TLRs基因的相對(duì)表達(dá)量變化情況。【結(jié)果】羅氏沼蝦MrToll1、MrToll2和MrToll3基因在各組織中廣泛表達(dá)，但存在組織表達(dá)差異性。MrToll1和MrToll2基因在鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，分別是在肝胰腺中相對(duì)表達(dá)量的19.26和20.03倍；MrToll3基因在神經(jīng)節(jié)中的相對(duì)表達(dá)量最高，是在肝胰腺中的10.13倍。感染溶藻弧菌懸液后，羅氏沼蝦死亡率隨時(shí)間的推移不斷升高，至注射感染72 h時(shí)死亡率達(dá)峰值（64%），隨后不再出現(xiàn)死亡。感染溶藻弧菌后羅氏沼蝦MrToll1基因表達(dá)量呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，注射感染后24 h的表達(dá)量達(dá)峰值；Mrtoll2基因表達(dá)量呈下降—升高—下降—升高的波動(dòng)變化趨勢(shì)，注射感染后24 h的表達(dá)量達(dá)峰值；MrToll3基因表達(dá)量急劇下降，且維持在較低水平?！窘Y(jié)論】羅氏沼蝦MrToll1基因是鰓組織抵御細(xì)菌感染的主要應(yīng)答基因，MrToll2基因可能參與鰓組織的其他免疫活動(dòng)，MrToll3基因的調(diào)控機(jī)制尚未清晰。

關(guān)鍵詞：羅氏沼蝦；Toll樣受體（TLRs）；表達(dá)差異；溶藻弧菌；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類(lèi)號(hào)： S945.41 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）04-0721-07

Abstract：【Objective】By analyzing the differential expressions of three Toll-like receptor（TLRs） genes including MrToll1， MrToll2， MrToll3 in different tissues of Macrobrachium rosenbergii and expression difference of gill at different times after infection with Vibrio alginolyticus， the present study provided reference for revealing immune function of M. rosenbergii TLRs in fighting diseases. 【Method】Real-time fluorescence quantitative RT-PCR was applied to detect relative expressions of MrToll1， MrToll2 and MrToll3 in muscle， gill， hepatopancreas， heart， stomach， gut， hemolymph， nerve ganglion， and eyestalk. The same method was also used to test the expression changes of TLRs gene after infected by V. alginolyticus. 【Result】MrToll1， MrToll2 and MrToll3 genes were expressed in all of the tested tissues and there also existed differential expressions. MrToll1 and MrToll2 genes highly expressed in gill among these tissues while the relative expression of MrToll1 and MrToll2 in gill were as much as 19.26 times and 20.03 times as those in hepatopancreases respectively. The expression of MrToll3 gene was the highest in nerve ganglions， which was as 10.13 times as that in hepatopancreases. After infected by V. Alginolyticus， mortality rate of M. rosenbergii increased as time spent， and reached the peak at 72 post infection（64%）. After 72 h post infection， no more mortality occurred. After infection with V. alginolyticus， the expression of MrToll1 gene rose first and then decreased， and reached the peak 24 h post infection. The expression of MrToll2 went through a down-up-down-up variation， and reached the maximum 24 h post infection. The expression of MrToll3 gene decreased sharply and maintained at low level. 【Conclusion】MrToll1 gene is major response gene for gill resisting bacterial infection， MrToll2 gene may be involved in other immune activities of gill， and regulation mechanism of MrToll3 is unknown.

Key words： Macrobrachium rosenbergii； Toll-like receptor（TLRs）； differential expression； Vibrio alginolyticus； real-time fluorescence quantitative PCR

0 引言

【研究意義】蝦類(lèi)免疫機(jī)制較簡(jiǎn)單，主要依靠先天免疫機(jī)制中的低端免疫系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫防御，包括體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。其中，體液免疫主要通過(guò)溶菌酶、凝集素酚氧化還原酶、細(xì)胞黏附分子、抗菌肽和其他活性成分有效誘導(dǎo)先天免疫應(yīng)答，細(xì)胞免疫則由不同類(lèi)型的血細(xì)胞通過(guò)凋亡、包裹、吞噬作用等一系列反應(yīng)來(lái)完成（Rowley and Powell，2007）。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是目前發(fā)現(xiàn)能識(shí)別僅表達(dá)在病原微生物上的高度保守結(jié)構(gòu)基序——病原相關(guān)分子模式的一組蛋白（楊敏等，2004）。TLRs在識(shí)別入侵病原微生物的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，受病原相關(guān)分子刺激而啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使細(xì)胞因子產(chǎn)生及協(xié)同刺激因子表達(dá)，在天然免疫和獲得性免疫中起到橋梁作用。【前人研究進(jìn)展】人類(lèi)TLRs的結(jié)構(gòu)、分布、功能及其與疾病的關(guān)系已有深入研究（唐深和冷靜，2004），但有關(guān)蝦類(lèi)TLRs的研究起步相對(duì)較晚，直到2007年Yang等才報(bào)道克隆獲得凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）Toll受體基因。隨后，多種對(duì)蝦Toll受體基因被發(fā)現(xiàn)（Ao et al.，2008；Mekata et al.，2008）。目前，針對(duì)甲殼動(dòng)物TLRs的研究主要集中在對(duì)蝦方面，已從蝦類(lèi)中克隆獲得11個(gè)TLRs基因。Wang等（2012）從凡納濱對(duì)蝦克隆獲得LvToll1、LvToll2和LvToll3等3個(gè)TLRs基因；第4個(gè)TLRs基因在斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）鰓的cDNA文庫(kù)中檢測(cè)獲得，且證實(shí)不存在組織表達(dá)特異性（Arts et al.，2007）。在中國(guó)明對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）及日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）體內(nèi)分別發(fā)現(xiàn)了1個(gè)TLRs基因，從斑節(jié)對(duì)蝦中還克隆獲得1個(gè)比第一條序列還長(zhǎng)的TLRs基因（Assavalapsakul and Panyim，2012）。本課題組前期從羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）克隆獲得3個(gè)TLRs基因（蘇建等，2014）。至今，已報(bào)道的幾種海洋無(wú)脊椎動(dòng)物TLRs基因均呈非組織特異性表達(dá)，如中國(guó)鱟（Tachypleus tridentatus）HsToll基因（Inamori et al.，2004）、凡納濱對(duì)蝦LvToll基因（Arts et al.，2007）、櫛孔扇貝（Chlamys farreri）CfToll-1基因（Qiu et al.，2007）、中國(guó)明蝦FcToll基因（Yang et al.，2008）和日本囊對(duì)蝦MjToll基因（Mekata et al.，2008）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】TLRs可識(shí)別各種不同的疾病相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），進(jìn)而激發(fā)先天免疫機(jī)制分泌有關(guān)炎癥因子、抗微生物蛋白等以阻止病原微生物入侵，而且可對(duì)抗原呈遞細(xì)胞發(fā)出預(yù)告，開(kāi)啟先天具有的免疫機(jī)制，但至今有關(guān)羅氏沼蝦TLRs免疫機(jī)理的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)羅氏沼蝦不同組織及感染溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）后TLRs基因表達(dá)量的差異變化進(jìn)行分析，為揭示羅氏沼蝦TLRs在應(yīng)對(duì)病害等免疫方面的表現(xiàn)和作用機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

羅氏沼蝦由上海申漕特種水產(chǎn)開(kāi)發(fā)公司親蝦塘提供，選取規(guī)格統(tǒng)一、體表無(wú)損傷的親蝦，測(cè)量體長(zhǎng)和體重，試驗(yàn)前在水泥池里暫養(yǎng)7 d。溶藻弧菌由上海海洋大學(xué)海洋生物實(shí)驗(yàn)室保存，從羅氏沼蝦養(yǎng)殖水體中分離鑒定獲得。試驗(yàn)用水槽為藍(lán)色塑料箱，其規(guī)格為70 cm×50 cm×40 cm（長(zhǎng)×寬×深），使用前洗凈并用5%高錳酸鉀溶液浸泡6 h后潤(rùn)洗備用。RNAiso Plus、PrimescriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser、pMD19-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱形）、DEPC、氨芐青霉素等購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。LBS液體培養(yǎng)基（1 L）：50 mL Tris（1 mol/L，pH 7.5），10 g胰蛋白胨，5 g母膏，20 g NaCl，加蒸餾水至1 L。主要儀器設(shè)備：臺(tái)式冷凍離心機(jī)、微量分光光度計(jì)、凝膠成像儀、核酸蛋白檢測(cè)儀、微量移液器、溫度梯度PCR儀和羅氏熒光定量PCR儀LightCycler 480。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 總RNA提取 羅氏沼蝦各組織用液氮速凍后研磨成粉末狀，用RNAiso Plus試劑提取各組織RNA。提取的RNA以DEPC-H2O溶解后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行定量測(cè)量，再用1.2%瓊脂糖變性膠檢測(cè)RNA完整性。確定RNA無(wú)降解后分裝并置于-80 ℃冰箱保存待用。

1. 2. 2 1.2%甲醛變性膠電泳 以3% H2O2浸泡電泳槽，然后用DEPC-H2O潤(rùn)洗；配制甲醛變性膠及上樣緩沖液，各組織RNA的添加量均為1.0 μg，制備25.0 μL上樣緩沖液體積，包括1.0 μg總RNA、2.5 μL 10×Mops、7.5 μL甲酰胺、2.7 μL甲醛、1.0 μL 6×Lodding Buffer和1.0 μL EB，向該配比溶液加DEPC-H2O至總體積25.0 μL。65 ℃變性10 min后立即冰上冷卻3 min。稱(chēng)取0.3 g瓊脂糖，加入22.0 mL DEPC-H2O，加熱至完全溶解，當(dāng)溫度降至55 ℃左右時(shí)加入1.5 mL 10×Mops和2.5 mL甲醛，制成電泳凝膠。電壓為5 V/cm，電泳緩沖液為1× Mops，電泳90 min，在凝膠成像儀上拍照并記錄。

1. 2. 3 cDNA合成 完整無(wú)降解的RNA用cDNA第一鏈合成試劑盒（PrimescriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser）中的RNase-free DNase I消化各組織的總RNA，消化步驟為5×gDNA Erase Buffer 2.0 μL， gDNA Erase 1.0 μL，各組織總RNA 1.0 μg，加RNase-free ddH2O補(bǔ)足至10.0 μL，42 ℃消化2 min。以已消化好的鰓組織RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體步驟：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。合成的cDNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 4 引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增 根據(jù)GenBank已發(fā)表的羅氏沼蝦MrToll1（KJ188410.1）、MrToll2（KJ188411.1）、MrToll3（KJ188412.1）和Mr18s（GQ131934.1）序列，在其保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)引物（表1），并用Oligo 6.0分析及評(píng)價(jià)其特異性。

采用設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DNA模板為反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA，反應(yīng)體系20.0 μL：2×Master Mix 10.0 μL，正、反向引物各0.2 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 8.6 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳在80 mA條件下進(jìn)行檢測(cè)。

1. 2. 5 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序 取25.0 μL PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NBCI中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1. 2. 6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0 μL，包括SYBR Premix Fx Taq 10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL（100 ng），ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 s（4.4 ℃/s）；95 ℃ 5 s（4.4 ℃/s），60 ℃ 30 s（2.2 ℃/s），進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。運(yùn)用反應(yīng)熔解曲線檢測(cè)其特異性，每尾蝦的每個(gè)組織設(shè)3個(gè)重復(fù)孔和一個(gè)內(nèi)參18S rRNA對(duì)照。羅氏沼蝦TLRs基因相對(duì)表達(dá)量采用Livak和Schmittgen（2001）建立的2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算，并以SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncans多重比較。

1. 2. 7 溶藻弧菌對(duì)羅氏沼蝦感染預(yù)試驗(yàn) 參考Chu等（2011）的方法，將溶藻弧菌轉(zhuǎn)接至LBS液體培養(yǎng)基中，在28 ℃下?lián)u床（150 r/min）培養(yǎng)24 h，利用細(xì)菌平板計(jì)數(shù)法將其稀釋至1.0×1010 CFU/mL。經(jīng)10000 r/min離心10 min，棄上清液，PBS洗滌重懸，按照同樣方法進(jìn)行3次離心。梯度稀釋溶藻弧菌懸浮液至1.0×108、1.0×107、1.0×106和1.0×105 CFU/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ?.85%無(wú)菌生理鹽水為對(duì)照組，在羅氏沼蝦的第二附肢基部注射溶藻弧菌（4個(gè)梯度濃度），注射劑量10 μL/g，每組10尾蝦，分別于注射攻毒后1、6、12、24、48、72和96 h觀察羅氏沼蝦死亡情況，參考顧兵等（2009）的Bliss加權(quán)法計(jì)算出感染正式試驗(yàn)所需的最佳菌懸液濃度。飼養(yǎng)管理：每天喂食2次，每天投餌量為體重的3%，每隔3 d換水1次，每次換水量為1/3～1/2，水溫保持在25～30 ℃，溶解氧保持在5 mg/L以上。

1. 2. 8 溶藻弧菌感染試驗(yàn)及樣品取樣 隨機(jī)挑選300尾羅氏沼蝦分成3組（感染組、對(duì)照組和空白組），50尾蝦/組，每組設(shè)2個(gè)平行，一個(gè)平行為檢測(cè)取樣，另一個(gè)平行為觀察試驗(yàn)。感染組：于第二附肢基部注射1.0×107 CFU/mL溶藻弧菌，注射劑量10 μL/g；對(duì)照組：于第二附肢基部注射等體積的0.85%無(wú)菌生理鹽水；空白組：不進(jìn)行任何處理。分別于注射攻毒后1、6、12、24、48、72和96 h觀察羅氏沼蝦死亡情況，然后從每組隨機(jī)抽取5尾體表無(wú)損傷的羅氏沼蝦，取鰓組織用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 總RNA完整性檢測(cè)結(jié)果

吸取1.0 μL不同組織RNA，使用微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦各組織總RNA的A260/A280均在1.8～2.1；用1.2%瓊脂糖變性膠檢測(cè)其完整性，電泳結(jié)果如圖1所示，可清楚觀察到各組織的總RNA條帶，且邊界清晰，說(shuō)明總RNA完整性良好且純度較高。

2. 2 羅氏沼蝦TLRs基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用引物MrToll1-F/MrToll1-R、MrToll2-F/MrToll2-R、MrToll3-F/MrToll3-R、Mr18S-F/Mr18SR對(duì)羅氏沼蝦各組織總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2所示。4對(duì)引物均能擴(kuò)增出單一清晰的目的條帶，且產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果一致。各擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其序列比對(duì)結(jié)果完全對(duì)應(yīng)各自的TLRs基因部分序列及羅氏沼蝦的18S rRNA部分基因序列。

2. 3 羅氏沼蝦TLRs基因在不同組織中表達(dá)量的比較

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)羅氏沼蝦3種TLRs基因在肌肉、肝胰腺、眼柄、心臟、胃、鰓、神經(jīng)節(jié)、血淋巴和腸中的相對(duì)表達(dá)量（將TLRs基因在肝胰腺中的相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1.0），結(jié)果顯示，3種TLRs基因在各組織中均有表達(dá)，但存在組織表達(dá)差異性（圖3）。其中，MrToll1基因在血淋巴、胃和鰓中的相對(duì)表達(dá)量較高，其次是腸、神經(jīng)節(jié)、眼柄、心臟和肌肉，在肝胰腺中的相對(duì)表達(dá)量較低，其在鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量是肝胰腺中的19.26倍；MrToll2基因在鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是神經(jīng)節(jié)、腸、胃、心臟、血淋巴和眼柄，在肝胰腺和肌肉中的相對(duì)表達(dá)量較低，其在鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量是在肝胰腺中的20.03倍；MrToll3基因在神經(jīng)節(jié)和心臟中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是鰓，在肝胰腺、血淋巴、眼柄、胃和肌肉中的相對(duì)表達(dá)量較低，其在心臟和神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)量分別是在肝胰腺中的10.13和8.88倍。

2. 4 羅氏沼蝦感染溶藻弧菌后的死亡率差異

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，溶藻弧菌感染羅氏沼蝦的最佳菌懸液濃度為1.0×107 CFU/mL。由表2可知，注射溶藻弧菌懸液后，感染組羅氏沼蝦死亡率隨時(shí)間的推移不斷升高，至注射感染72 h時(shí)死亡率達(dá)峰值（64%），隨后不再出現(xiàn)死亡；而對(duì)照組和空白組均未出現(xiàn)羅氏沼蝦死亡現(xiàn)象。此外，感染組羅氏沼蝦表現(xiàn)較異常：行動(dòng)遲緩，反應(yīng)遲鈍，攝食量明顯減少，會(huì)趴在遮蔽處?kù)o伏，但感染72 h后受感染的羅氏沼蝦行動(dòng)力增強(qiáng)，攝食量增加。對(duì)照組和空白組羅氏沼蝦的行為及攝食與正常蝦相似。

2. 5 羅氏沼蝦感染溶藻弧菌后TLRs基因相對(duì)表達(dá)量的變化

從圖4可看出，感染溶藻弧菌后羅氏沼蝦3種TLRs基因相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間推移表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。感染溶藻弧菌后，對(duì)照組MrToll1基因相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)忽高忽低的波動(dòng)，與感染前（0 h）相比，在感染后1、12、24和48 h均出現(xiàn)顯著差異（P<0.05，下同）。感染組MrToll1基因相對(duì)表達(dá)量呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，至感染后24 h的相對(duì)表達(dá)量達(dá)峰值，是感染前（0 h）相對(duì)表達(dá)量的4.97倍，感染后6、12、24和48 h的相對(duì)表達(dá)量較感染前均達(dá)顯著差異水平，且顯著高于同一時(shí)間對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量?？瞻捉MMrToll1基因在不同時(shí)間點(diǎn)（除感染后12 h外）的相對(duì)表達(dá)量與感染前相比差異均不顯著（P>0.05，下同）。

感染溶藻弧菌后，對(duì)照組中MrToll2基因相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)忽高忽低的波動(dòng)，與感染前（0 h）相比僅在感染后72 h出現(xiàn)顯著差異。感染組MrToll2基因相對(duì)表達(dá)量呈下降—升高—下降—升高的波動(dòng)變化趨勢(shì)，至感染后24 h的相對(duì)表達(dá)量達(dá)峰值，是感染前（0 h）相對(duì)表達(dá)量的1.32倍，感染后1、6、48、72和96 h的相對(duì)表達(dá)量較感染前（0 h）均達(dá)顯著差異水平，且除感染后24 h外，其他時(shí)間點(diǎn)感染組的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組。空白組MrToll2基因的相對(duì)表達(dá)量波動(dòng)較小，與感染前（0 h）相比未達(dá)顯著差異水平。

在感染溶藻弧菌初期（1～12 h），羅氏沼蝦鰓組織中MrToll3基因相對(duì)表達(dá)量在感染組和對(duì)照組整體上呈降低趨勢(shì)，且均維持在較低水平。其中，感染組MrToll3基因相對(duì)表達(dá)量在感染后1～72 h顯著低于空白組。感染組在感染后12 h達(dá)最低值，其相對(duì)表達(dá)量?jī)H為感染前（0 h）的13%。由此推測(cè)，MrToll3基因與刺激相關(guān)，如注射等物理刺激均能引起其表達(dá)量發(fā)生較大變化。

3 討論

羅氏沼蝦食性廣、生長(zhǎng)快、肉質(zhì)鮮嫩，是目前全球養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦種之一（劉波等，2010）。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖水域環(huán)境不斷惡化，蝦類(lèi)也衍生出越來(lái)越多的疾病（徐海圣，2003；Wang et al.，2007），包括一些能給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大危害的傳染性疾病。其中由溶藻弧菌引起的弧菌病因發(fā)病率高、傳播速度快，已成為蝦類(lèi)養(yǎng)殖的主要傳染性疾病，給世界蝦類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失（Lee et al.，1996；Selvin and Lipton，2003）。因此，了解蝦類(lèi)的免疫機(jī)制，加強(qiáng)其免疫機(jī)能研究，是防控蝦類(lèi)疾病流行傳播的有效途徑。本研究通過(guò)分析羅氏沼蝦TLRs基因組織表達(dá)差異研究其應(yīng)對(duì)病害等免疫方面的表現(xiàn)和作用機(jī)理，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦MrToll1和MrToll2基因在鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，在肝胰腺組織中的相對(duì)表達(dá)量最低，與凡納濱對(duì)蝦LvToll2基因（Yang et al.，2007；黃旭雄等，2012）、中國(guó)明對(duì)蝦FcToll基因（Yang et al.，2008）的組織相對(duì)表達(dá)情況基本一致。

血淋巴細(xì)胞不僅是蝦類(lèi)免疫系統(tǒng)中最重要的組成成分，還是免疫功能（包括識(shí)別、吞噬、黑化和細(xì)胞間信息傳遞）的主要完成者（Johansson et al.，2000）。多數(shù)非細(xì)胞類(lèi)免疫因子通過(guò)其他途徑或多或少地與血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生聯(lián)系。蝦類(lèi)的鰓部與外界環(huán)境直接接觸，其細(xì)胞參與多種生理功能活動(dòng)（如呼吸、滲透壓調(diào)節(jié)和解毒作用），對(duì)環(huán)境中生物或非生物因子的變化十分敏感，當(dāng)給蝦類(lèi)注射異物顆粒時(shí)，其血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的免疫反應(yīng)——包囊作用主要在鰓部進(jìn)行（Burgents et al.，2005）。脂多糖因子在中國(guó)明對(duì)蝦的鰓部、腸道和血淋巴細(xì)胞中表達(dá)量很高，而在肌肉、肝胰腺和卵巢組織中表達(dá)量較低（Liu et al.，2005）。這些都說(shuō)明在抵抗病原微生物入侵過(guò)程中鰓組織和淋巴細(xì)胞均發(fā)揮了至關(guān)重要的作用（Tauszig et al.，2000；Gay and Gangloff，2007；O'Neill and Bowie，2007），因此推測(cè)MrToll1和MrToll2基因與抵抗病原微生物相關(guān)。本研究結(jié)果表明，羅氏沼蝦MrToll1和MrToll2基因在鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，進(jìn)一步佐證MrToll1和MrToll2基因在羅氏沼蝦中也應(yīng)該是與抵抗病原微生物相關(guān)的基因。

Yang等（2008）以滅活的鰻弧菌（Vibrioan guillarum）感染中國(guó)明對(duì)蝦，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLRs基因的表達(dá)量在注射后5 h內(nèi)顯著下降，但從第8 h時(shí)開(kāi)始顯著上調(diào)，直至注射后23 h達(dá)峰值。Han-Ching Wang等（2010）以8.3×103 CFU/g哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）感染凡納濱對(duì)蝦，發(fā)現(xiàn)TLRs基因表達(dá)量于注射后24 h達(dá)峰值，為對(duì)照組的15.17倍。本研究結(jié)果表明，羅氏沼蝦鰓組織中TLRs基因的相對(duì)表達(dá)量在感染早期呈下降趨勢(shì)，之后逐漸上升，至感染后24 h達(dá)峰值，與上述研究結(jié)果相似。說(shuō)明TLRs參與了對(duì)蝦抵抗革蘭氏陰性菌的免疫反應(yīng)。凡納濱對(duì)蝦在注射溶藻弧菌（1×107 CFU/mL）后鰓組織中LvToll1基因表達(dá)量在注射后12和24 h均顯著高于未感染組（Wang et al.，2012）；日本囊對(duì)蝦經(jīng)1×105 CFU/mL黑美人弧菌（V. nigripulchritudo）感染后，TLRs基因表達(dá)量在注射后12和24 h均顯著上調(diào)（Fall et al.，2010）。本研究中，溶藻弧菌感染組羅氏沼蝦MrToll1基因相對(duì)表達(dá)量在感染后1～48 h顯著上調(diào)，且在第24 h達(dá)峰值，而對(duì)照組羅氏沼蝦MrToll1基因相對(duì)表達(dá)量在各時(shí)間無(wú)顯著差異（除24 h顯著下調(diào)外），表明MrToll1直接參與了抵御溶藻弧菌入侵的信號(hào)通路，且很可能呈正相關(guān)。MrToll2基因在感染后呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，除第24 h外，其他各時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組和空白組，說(shuō)明溶藻弧菌入侵后在一定程度上能抑制MrToll2基因表達(dá)，與中國(guó)明對(duì)蝦的調(diào)節(jié)機(jī)制相似。MrToll3基因的調(diào)控機(jī)制尚未清晰，其與免疫調(diào)控是否存在關(guān)聯(lián)尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié)論

羅氏沼蝦MrToll1基因是鰓組織抵御細(xì)菌感染的主要應(yīng)答基因，MrToll2基因可能參與鰓組織的其他免疫活動(dòng)，MrToll3基因的調(diào)控機(jī)制尚未清晰。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）