植物內質網小分子量熱激蛋白的生物學功能

李妹芳　苗紀忠

摘要介紹了植物ERsHSP的結構特點、分子伴侶活性及逆境抗性等生物學功能，并展望了該領域今后的研究方向，為深入研究植物的逆境脅迫機制以及分子水平的作物育種提供了新思路。

關鍵詞內質網小分子量熱激蛋白；分子伴侶；逆境抗性；內質網應激

中圖分類號Q946.1文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）30-0007-03

AbstractThe structure of plant endoplasmic reticulumlocalied small heat shock protein（ERsHSP） characteristics，biological function as molecular chaperone activity and adversity resistance were reviewed，and research direction in this field was analyzed，which lay a foundation for further research of plant adversity stress mechanism，and provided a new way for molecular plant breeding.

Key wordsERsHSP；Molecular chaperone；Stress resistance；ERstress

熱激蛋白（HSP）是生物體在高溫、低溫、干旱等脅迫下合成的一類應激蛋白，是保守的核基因家族[1]。根據分子量的大小分為 HSP110、HSP90、HSP70、HSP50和小分子量熱激蛋白（sHSP，17～30 kD）。sHSP在植物中種類多，分布廣。根據分布和結構特征常分為細胞質 Ⅰ 類 sHSP （Class Ⅰ sHSP）、 細胞質 Ⅱ 類 sHSP （Class Ⅱ sHSP） 和細胞器sHSP，其中細胞器sHSP分為葉綠體 sHSP （CPsHSP）、線粒體sHSP （MTsHSP） 和內膜sHSP （一般指的是內質網sHSP，即ERsHSP）[2]。后來在擬南芥中又發現了一類新的胞質定位的sHSPs家族——Class Ⅲ[3]。

ERsHSP（Endoplasmic reticulumlocalized sHSP）是定位于內質網中的一類sHSP。內質網占細胞膜系統的50%左右，是蛋白質、脂質合成的主要場所。在逆境脅迫下細胞的最初反應是內質網應激[4]。內質網應激發生時，蛋白質異常折疊積累，脂類合成受阻，從而導致生理活動失衡。但同時可以激活內質網內的HSP執行分子伴侶功能，降低次生傷害。GRP78或Bip是內質網中2種標志性HSP，在異常蛋白質的重新折疊和裝配過程中發揮分子伴侶作用。Cooper等[5]于1987年首次報道熱激處理的玉米中表達出ERsHSP，1990年Sticher等[6]發現熱激處理大麥，誘導表達的ERsHSP對內質網中的標志性酶起保護作用。隨后又在高溫處理的豌豆、番茄、擬南芥以及低溫脅迫的馬鈴薯等多種植物中檢測出ERsHSP[7-11]。逆境是造成作物減產和限制種植廣度的主要因素，研究證實ERsHSP的表達與植物逆境抗性密切相關。筆者介紹了ERsHSP的生物學功能，以期為深入研究植物的逆境脅迫機制以及分子水平的作物育種提供參考。

1ERsHSP的結構特點

HSP是很保守的蛋白質之一。即使是原核生物和真核生物之間，同分子量HSP的同源性也較高。不同植物相同種類的HSP同樣具有較高的同源性，同種生物不同類型的HSP的同源性則較低[12]，但ERsHSP與Class Ⅰ sHsP的同源性相對高些[7]。sHsP的氨基酸序列包括可變N端、保守的C端結構域（即α-結晶蛋白域） 和自由的C端延伸部分（圖1）[13]。研究者通過對5種sHSPs （Class Ⅰ sHSP、 Class Ⅱ sHSP、CPsHSP、MTsHsP 和 ERsHSp）的氨基酸序列進行同源性分析，發現與其他sHSP相同，ER-sHSP的C末端也共有一段保守熱激區域，具有-PGL和-VGL 2個基序，保守區之間是氨基酸數目可變的親水區[2]， 這2個基序是高度保守的，表明ER-sHSP應該與其他sHSP一樣，在植物體內擔任分子伴侶的角色。sHSP之間分子量的差異主要由于在N端WDPF域和α-結晶蛋白域之間的片段長度不同，以及C端延伸片段的長度不同造成的[14]。

不同植物的ERsHSP氨基酸序列分析表明，ERsHSP除了C末端的2個保守區之外，N末端還有多個同源序列，可能賦予ERsHSP特別的功能[15]。另外，ERsHSP的C末端含有一段四肽殘基，與內質網滯留序列KDEL、HDEL和KNEL類似[16-18]，可能與ERsHSP的特殊定位有關。

2ERsHSP的分子伴侶功能

熱激蛋白是最早被發現的一類分子伴侶，在高溫脅迫時和恢復期，檢測到15～18 kD sHSP在細胞質和細胞器之間往返，執行分子伴侶的功能，減少高溫傷害，修復被損傷的蛋白質[18]。研究表明，sHSP的C末端的α-結晶蛋白結構域與其分子伴侶活性密切相關[19-21]，在多種脅迫條件下可以誘導合成sHSP，與相應底物蛋白質結合，使其構象發生相應改變，從而阻止底物蛋白質的異常積聚，保持了蛋白質合成的正常進行[22]。因此，sHSP與植物的脅迫抗性密切相關。ERsHSP作為sHSP家族成員之一，也具有分子伴侶功能。

細胞中的蛋白質合成有大約1/3在內質網中進行，迄今為止只在植物中檢測出ERsHSP。研究表明，內質網中過量表達BiP（HSP70同系物）可以恢復細胞在脅迫條件下蛋白合成的速率，從而提高生物體脅迫抗性。由于sHSP結合底物更加靈活多樣，推測過量表達的ERsHSP可以和其他分子伴侶一起幫助蛋白質重新正確折疊[22]，減少脅迫下內質網中變性蛋白的積累，減少逆境對蛋白合成的影響，所以具有更重要的分子伴侶作用[23-24]。Mamedov等[25]證實ERsHSP（LeHSP21.5）可以在活體外有效阻止可溶蛋白的熱變性。在擬南芥中細胞質小分子量熱激蛋白HSP17.8可以作為分子伴侶幫助合成的質體外膜蛋白（AKR2A）到達正確位點[26]，葉綠體小分子量熱激蛋白HSP21和pTAC5互作，是質體發育的必要條件[27]；在非生物脅迫下，大豆中內質網小分子量熱激蛋白PvNod22可以阻止低溫下內質網中變性蛋白的積累，從而保持內質網的穩態[28]。大多數sHSP的分子伴侶活性不依賴ATP，但被依賴ATP的 Hsp70/DnaK激活[29]，至于ERsHSP與其他分子伴侶（如BiP）的關系、互作位點以及信號轉導途徑等仍需進一步研究。

3ERsHSP與植物的抗逆性

ERsHSP作為sHSP家族成員，具有分子伴侶活性，在逆境條件下幫助蛋白質重新正確折疊及復性，從而保證了植物體內多種生理生化反應的正常進行，與植物的耐熱性、抗冷性的提高等密切相關。

3.1ERsHSP與植物的耐熱性

關于高溫熱激誘導ERsHSP的產生并提高植物耐熱性的研究報道較多。研究者在豌豆幼苗中進行免疫印跡試驗，發現PsHSP22.7基因在室溫（21 ℃）時不表達，在熱激（40 ℃）時迅速積累，表明該基因可能與植物葉片的耐熱性相關[9]。劉箭等[30]的Northern雜交試驗表明，隨著溫度的升高番茄中ERsHSP（LeHSP21.5）基因的表達量增加，并且在不同組織中表達的起始溫度不同，在葉中的是36 ℃時開始表達，在花中是32 ℃， ERsHSP的表達量與植物的耐熱能力相關，表明花的耐熱性低于葉。在擬南芥中熱激產生的AtHSP22也可提高耐熱性[7]。

3.2ERsHSP與植物的耐冷性

長期研究發現sHSP除了抵御高溫外，對低溫脅迫下的植物也具有保護作用。Sabehat等[31]將番茄果實熱激（38 ℃）48 h后，再低溫（2 ℃）處理，與未經過熱激的對照相比，發現熱激后的果實抗冷性提高，其效果可持續21 d。在冬季低溫條件下，桑樹皮層薄壁細胞中的內質網形態會發生變化，從潴泡狀變成小囊泡，同時檢測有大量ERsHSP，從而提高抗寒能力，WAP27和WAP20明顯增加[32]。低溫也能誘導馬鈴薯塊莖中C119基因表達，ERsHSP的表達與植物的抗寒能力密切相關[10]。趙春梅等[33-34]將ERsHSP基因導入番茄，MDA、電解質外滲及Fv/Fm等生理指標表明，組成性表達ERsHSP的轉基因番茄的抗冷性優于野生型或轉空載體，證實了過量表達ERsHSP的轉基因番茄植株具有較強的抗冷能力。

內質網是脂類合成的主要場所。Lyons[35]認為低溫首先傷害植物生物膜的類脂分子。膜脂不飽和度越大，膜脂相變溫度就越低，從而有利于保持生物膜在低溫時的流動性，維持正常生理活動。組成性表達的ERsHSP有助于保持各種脂類合成酶的活性，從而保證了類脂分子（包括低相變溫度的脂類）的正常合成，提高植物的抗寒性[33]。對Synechocystis PCC6803中的HSP17研究表明，sHSP可以調節膜脂的多態性。穩定生物膜的液晶態，在低溫逆境溫度條件下對膜脂的流動性具有一定的保護作用。體外試驗表明，保守的sHSP的α-晶體結構區域可以結合于質膜并且合成磷脂泡狀體，幫助變性蛋白重新正確折疊[36-37]。在溫度逆境條件下向離體的類囊體膜中添加外源葉綠體HSP21對PS Ⅱ 有一定的保護作用[38]。抗冷植物的不飽和脂肪酸含量高，相變溫度低，所以能在低溫下保持生物膜的流動性來維持正常生理活動。過量表達葉綠體小分子量熱激蛋白CaHSP26可以提高低溫脅迫下煙草生物膜的不飽和度，減輕低溫造成的光抑制[39-40]。 ERsHSP可以通過脫落酸途徑提高植物耐冷性[41]。過量表達甘油-3-磷酸酰基轉移酶基因使植物細胞內磷脂酰甘油不飽和脂肪酸增加，提高了番茄的低溫抗性[42]，表明低溫脅迫時植物體可能通過某些途徑增加生物膜脂不飽和度，抵抗低溫傷害。

ERsHSP在番茄中過量表達，在低溫條件下可以降低MDA的積累，減少電解質外滲，表明ERsHSP可以保護生物膜[33]，但是這種保護作用是否可涉及其他的細胞器膜系統，以及ERsHSP所起的具體作用還需要深入研究。

4ERsHSP與ER-Stress

內質網是重要的細胞器，很多的蛋白質（如分泌蛋白、跨膜蛋白和內質網駐留蛋白等）需要進入內質網腔內進行翻譯后的修飾、折疊和寡聚化，才能形成正確的構象。逆境會導致未折疊的異常蛋白增多，超出內質網的處理能力時，就引起ER-Stress，隨即內質網會啟動未折疊蛋白反應（UPR）， UPR信號通路可以誘導內質網分子伴侶的表達，幫助蛋白質進行折疊和運輸、降解冗余的蛋白質，并且控制分泌型蛋白進入內質網的數量。ERsHSP是內質網分子伴侶中的重要成員，內質網分子伴侶還包括葡萄糖調節蛋白家族成員、蛋白質二硫鍵異構酶和類凝集素分子伴侶等[14]。前期的研究表明，ERsHSP具有特殊的結構特點，在ER-Stress中能夠起到保護作用[33]。衣霉素處理14 d后，ERsHSP的轉基因番茄仍然長勢良好，而野生型和轉空載體的植株葉子萎縮，表明ERsHSP的積累可以減輕ER-Stress。研究表明，ERsHSP減少了其他內質網分子伴侶的誘導表達，可能直接參與了UPR信號的調控[34]。

植物UPR信號通路除了誘導內質網分子伴侶的表達以外，還涉及蛋白酶的降解途徑。內質網定位的堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子是UPR信號通路中的感受蛋白。在擬南芥中已鑒定出3種堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子。其中，AtbZIP17是由鹽脅迫誘導激活[43]，與植物耐鹽性相關。AtbZIP28受衣霉素誘導被水解并釋放其N端區域，隨后從內質網至細胞核中，激活ER-Stress應答基因的表達[44]。AtbZIP60受衣霉素和二硫蘇糖醇等的誘導激活[45]。

5展望

ERsHSP的研究起步比細胞質sHSP和CPsHSP晚。ERsHSP作為內質網分子伴侶中的重要成員，可以減輕 ER-Stress，從而降低了UPR。近年來，ERsHSP的研究逐漸受到重視[33-34，41-42]。迄今為止，人們對植物ERsHSP的結構和生物功能等的研究還不夠全面[46]。在溫度逆境脅迫時，植物體內有ERsHSP生成積累，伴隨著抗性增強，推測其在提高植物抗性方面發揮作用。ERsHSP對衣霉素等引起的ER-Stress有保護作用，是否可以保護線粒體、葉綠體等其他的內膜系統，是直接作用還是間接作用，有待于進一步探討。UPR是一條從內質網到細胞核的信號傳導途徑，其如何影響膜脂組成和狀態的變化，進而影響細胞的代謝活動和生理狀態，也有待于進一步研究。研究分子伴侶的作用機理可以揭示植物細胞抗逆性的分子機制，并可以為分子水平上培育抗逆品種提供新思路。

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