山羊誘導性多能干細胞培養體系的篩選

宋輝　李卉　王鋒

摘要[目的]使用多種培養成分組合，篩選出一個適合山羊誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的培養體系。[方法]采用慢病毒作為載體，攜帶多能因子，采用多種培養成分（培養基、血清和細胞因子）的組合培養山羊iPSCs，優化其培養體系。[結果]用FBS代替KSR可以提高克隆的形成效率以及克隆的質量，而用DMEM/F12代替KNOCKOUT-DMEM，iPSCs克隆的形成效率和克隆質量沒有明顯的改善。帶有β-FGF的培養體系可以保持iPSCs未分化的狀態，而培養體系中只加LIF不能維持iPSCs未分化的狀態。[結論]該研究成功誘導出山羊iPSCs，且能在體外傳代培養。

關鍵詞誘導性多能干細胞；重編程；培養體系

中圖分類號S827文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）30-0131-03

Abstract[Objective]A culture system suitable for goatinduced pluripotent stem cells （iPSCs） was screened by using combination of various culture components.[Method]With the lentivirus as vector carrying pluripotency factor，goat iPSCs were cultured with a variety of culture components （culture medium，serum and cytokine） to optimize the culture system.[Result]The forming efficiency and clone quality of clones could be improved by FBS instead of KSR.The forming efficiency and clone quality of iPSCs clones were not improved by DMEM /F12 instead of KNOCKOUTDMEM.The culture system with βFGF could maintain the undifferentiated state of iPSCs，while only LIF could only maintain the undifferentiated state of iPSCs in the culture system.[Conclusion]Goat iPSCs were successfully induced and cultured in vitro.

Key wordsInduced pluripotent stem cells；Reprogramming；Culture system

胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ESCs）是從囊胚的內細胞團和早期胚胎的生殖腺分離的多能細胞。在體外適宜條件下，ESCs可以保持未分化狀態并且無限增殖，同時可以分化為機體的任何組織細胞。ESCs對于胚胎正常發生及其異常發育、開發合成藥物和胚胎瘤檢測的研究具有重要的意義，同時可為組織移植、器官置換和基因治療等提供重要的幫助。除此之外，ESCs在畜牧業生產上也有廣泛的用途。ESCs與轉基因技術及體細胞核移植技術結合能夠提高核移植效率，從而提高家畜的生產性能和抗病性能。山羊是一種重要家畜，科研人員試圖建立山羊等家畜ESCs，但是由于不能確定建系所需最適合的胚胎階段和家畜ESCs最佳的培養體系，導致家畜ESCs一直沒有建系成功[1]。該研究使用地方品種波雜山羊耳成纖維細胞作為體細胞，通過慢病毒感染進行體細胞重編程，獲得波雜山羊誘導性多能干細胞（giPSCs），比較分析山羊iPSCs最優的培養體系，以期篩選出一個適合山羊ESCs的培養條件。

1材料與方法

1.1主要試劑KNOCKOUT-DMEM培養基、DMEM培養基、DMEM/F12培養基、胎牛血清（FBS）、血清替代物（KSR）、非必需氨基酸（NEAA）、雙抗、無鈣鎂PBS緩沖液、胰蛋白酶、谷氨酰胺、二甲基亞砜（DMSO）、β-巰基乙醇（β-ME）、脂質體（Lipofectamine TM 2000）均購置于美國Life公司；質粒提取試劑盒購置于美國Omega公司； DNA Maker購置于日本TaKaRa公司；絲裂霉素-C（MIT-C）購置于瑞士Roche公司；白細胞抑制因子（LIF）、成纖維細胞生長因子（β-FGF）購置于美國Peprotech公司。

1.2方法

1.2.1山羊耳成纖維細胞培養。 除凈山羊耳組織上的毛發，再用碘酊消毒，乙醇脫碘。用滅過菌的眼科剪迅速剪下一塊大小合適的皮膚組織，放在加有雙抗的滅菌PBS帶到實驗室。將滅菌好的耳組織放到一個滅菌的培養皿中，拿到超凈工作臺，用滅菌的手術刀片將毛發徹底清理干凈，浸泡在70%乙醇中30 s進行滅菌，PBS漂洗3遍。用消毒的眼科剪和眼科鑷取下耳的軟骨組織，將剩余的皮膚組織剪成1 mm3的組織塊。用消毒彎頭巴氏吸管將小組織塊轉移至T25細胞培養瓶中，用彎頭巴氏吸管使組織塊以合適的密度均勻分布在瓶底上，放在培養箱中3～4 h。加入2 mL培養液，放入培養箱，第2天補加3～4 mL培養液，每隔2～3 d觀察并換液。待細胞匯合至50%～60%時，用0.25%胰酶消化傳代。由于成纖維細胞比上皮細胞對胰酶更敏感，前3代傳代后，在顯微鏡下看到細胞剛變圓即終止消化，只收集懸浮的細胞，這樣便可得到純度比較高的成纖維細胞。待細胞匯合至70%～80%時，即可冷凍保存供長期使用。

1.2.2飼養層細胞制備。 以10 μg/mL濃度絲裂霉素C（Mitomycin-C）處理小鼠胎兒成纖維細胞（Mouse embryonic fibroblast，MEF） （80%～90%融合為宜），置培養箱中2.5 h。取新的培養皿，加0.1%明膠（Gelatin）溶液覆蓋預處理30 min以上。取出Mitomycin-C處理好的MEF，吸棄廢液，用37 ℃預熱DPBS洗5遍，用適量胰酶消化成單細胞懸液。取出0.1%Gelatin處理的培養皿，吸出Gelatin，將MEF的細胞懸液按適當的密度鋪板。鋪好的飼養層在3 d內有效，可以支持iPSCs生長并維持其全能性。

1.2.3山羊iPSCs誘導及培養體系的建立。 感染前，在6孔板的一個孔里鋪上羊耳成纖維細胞。待細胞匯合到80%時，加入病毒感染液感染（每孔的感染液為每種病毒濃縮液按照1∶1∶1∶1的比例加入到1 mL體細胞培養液，混勻）。24 h后將病毒感染液吸出，加入體細胞培養液，24 h后重復感染一次。4 d后，用胰酶消化病毒感染的羊耳成纖維細胞，按一定的比例鋪到事先準備好的飼養層上，每天換液，在第6天用ESCs培養基代替體細胞培養基繼續培養，直到出現克隆（表1）。在病毒感染后12～15 d出現小的ESCs樣的克隆。繼續培養3～5 d，克隆不斷變大，準備克隆的挑取。用1 mL無菌注射器的針尖將克隆分成由幾十個細胞組成的小克隆，然后將這些小克隆傳到24孔板上，1個克隆傳1個孔，24孔板事先已經鋪好飼養層。5～7 d后，用1 mL無菌注射器的針尖對24孔板中的克隆進行第2次傳代，方法同上，其中3/4的克隆傳到鋪有飼養層的12孔板或者6孔板（根據克隆數量的多少而定），剩下1/4的克隆傳到鋪有飼養層的48孔板上，標記清楚，一一對應。

2結果與分析

2.1羊耳成纖維細胞的形態學觀察

組織塊貼壁2～3 d后，可以在顯微鏡下看到組織塊周圍長出上皮細胞，隨后成纖維細胞沿組織塊周圍開始生長。5 d后成纖維細胞大量擴增，生長迅速，表現出很強的分裂增殖能力（圖1A、B）。待原代細胞匯合至80%～90%時，中間夾雜著一些卵圓形的上皮細胞，經過3～4代的傳代即可除去混雜的上皮細胞，得到純度很高的成纖維細胞。

2.2山羊iPSCs培養條件

由表2可知，

用FBS代替KSR可以提高克隆的形成效率以及克隆的質量，而用DMEM/F12代替KNOCKOUT-DMEM，iPSCs克隆的形成效率和克隆質量沒有明顯改善。帶有β-FGF的培養體系可以保持iPSCs未分化的狀態，而培養體系中只加LIF不能維持iPSCs未分化的狀態，說明β-FGF對于羊iPSCs多能性的維持是必需的（圖2A、B）。

3結論與討論

家畜的ESCs一直沒有建系成功，一個很重要的原因是在分離和培養家畜ESCs時，一直都是用人或鼠的ESCs培養條件。雖然相關研究人員做了很多嘗試，但是仍然不能確定家畜ESCs最佳的培養條件[2-6]。

Ren等[7]研究人員使用DMEM/F12+20%KSR誘導產生山羊iPSCs，在整個重編程以及后期iPSCs的培養過程中，培養液中一直要添加1 μg/mL DOX，目的是讓外源轉錄基因持續表達，從而維持山羊iPSCs未分化的狀態。通過檢測發現，在此試驗中得到的山羊iPSCs，內源性的多能基因并沒有被重新激活，一旦iPSCs的培養液中不添加DOX，外源多能基因發生沉默，iPSCs會自動分化。在此試驗的誘導和培養體系中使用MEF作為飼養層，沒有添加任何細胞因子。Bao等[8]研究人員建立綿羊iPSCs過程中也使用相同的誘導和培養體系。Li等[9]建立綿羊iPSCs過程中，使用2種培養體系：Knock-out DMEM+20%KSR+4 ng/mL人源β-FGF和Knock-out DMEM+20% FBS+4 ng/mL人源β-FGF，結果表明，添加FBS可以顯著地增加重編程的效率，但是培養液中仍然要添加DOX去維持外源轉錄基因的持續表達，否則，誘導效率會很低[9]。Liu等[10]使用DMEM+20% FBS+4 ng/mL人源β-FGF培養體系，誘導出綿羊iPSCs。

該試驗在前人研究的基礎上，在干細胞無血清培養體系KNOCKOUT-DMEM+KSRK中分別添加人源LIF、人源β-FGF，以及兩者都加，結果表明，在培養體系中添加LIF無法維持山羊iPSCs未分化的狀態，而添加β-FGF或者兩者都加可以維持山羊iPSCs未分化的狀態，說明培養液中必須添加人源的β-FGF才可以維持山羊iPSCs未分化狀態，但是試驗中培養山羊iPSCs使用的培養液添加的是人源β-FGF，對于維持山羊iPSCs未分化狀態最佳的細胞因子是什么，還無法下肯定的結論。

家畜ESCs和iPSCs建系經常使用培養基DMEM/F12和血清FBS，結果表明使用FBS對于山羊iPSCs未分化狀態的維持要優于KSR，這一點與Li等[9]的試驗結論相似。但是KSR是一個成分明確的血清替代物，而FBS的成分很復雜，給一些干細胞水平研究增加了一些不確定因素，但是可以得知，在FBS中含有的一些KSR中沒有的成分，對于羊iPSCs未分化狀態的維持具有一些有益的幫助，這些成分是什么還需要進一步的研究確定。

參考文獻

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