小菜蛾表皮蛋白基因克隆及表達分析

申建梅　陳炳翰　郭曉潔　胡黎明

摘要：【目的】克隆小菜蛾表皮蛋白基因（Plutellaxylostella cuticularprotein，PxyICP），分析其序列特征和發育表達模式，為深入研究PxyICP在小菜蛾表皮形成中的生理功能提供科學參考。【方法】以小菜蛾為試驗材料，采用反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）和快速擴增cDNA末端（RACE）技術克術克隆PxyICP，以生物信息學方法對其序列特征進行分析，并采用實時熒光定量PCR研究PxyICP mRNA在小菜蛾不同發育時期中的相對表達量。【結果】克隆獲得的PxyICP基因開放閱讀框長531 bp，編碼177個氨基酸，相對分子質量約18.90 kD，等電點為5.32。氨基酸序列分析結果表明，小菜蛾表皮蛋白第1～16位氨基酸是參與跨膜蛋白轉移的信號肽，且該序列具有昆蟲表皮蛋白CPR家族中RR-1型保守基序的典型特征。不同發育時期的實時熒光定量PCR分析結果表明，PxyICP在小菜蛾各發育時期的表達量不同，其中PxylCP在2、3和4齡幼蟲、蛹和成蟲中的表達量分別是1齡幼蟲的2.43、0.51、0.63、3.195和12.32倍，以在成蟲的表達量最高。【結論】成功克隆獲得PxyICP基因，根據其發育表達模式推測PxyICP蛋白參與小菜蛾成蟲表皮的硬化和黑化等生理過程。

關鍵詞：小菜蛾；表皮蛋白；基因克隆；實時熒光定量PCR

中圖分類號：S436.341.24 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）12-2176-06

0引言

【研究意義】小菜蛾[Plutella xylostella（Linnae-us）]為鱗翅目菜蛾科昆蟲，主要危害十字花科蔬菜，致使十字花科作物的品質和產量大幅降低，甚至絕收。其年發生世代多、繁殖率高、世代重疊現象嚴重（Furlong et al.，2013）。目前，生產上主要采用化學藥劑防治小菜蛾，但由于過度使用化學藥劑使得小菜蛾已對有機磷、有機氯和擬除蟲菊酯類等多種殺蟲劑產生不同程度的抗藥性（馮夏等，2011；Sun et al.，2012；夏耀民等，2013；蘇文敏等，2016）。昆蟲表皮是昆蟲抵御外界不良環境的第一道防線，其在昆蟲保持體形和防止體內水分蒸發等生命活動中具有重要作用，昆蟲可通過調節表皮滲透能力而產生抗藥性（Andersen et al.，1995）。表皮蛋白ICP（Cu-ticular protein）是構成昆蟲表皮的主要成分，因此，如果以小菜蛾表皮的重要構建元素——表皮蛋白作為藥物防治靶點來設計新型藥物，可嚴重破壞小菜蛾表皮組成、結構的完整性及外骨骼構建等，同時有助于提高藥劑對小菜蛾體壁的穿透以提高藥劑的毒殺效果，這將有效提高對小菜蛾的防治效果，為小菜蛾防控提供新的策略。【前人研究進展】昆蟲表皮蛋白是一種結構蛋白，是構成昆蟲體壁的重要組成成分，在昆蟲角質層抵御外界不良環境中發揮著不可或缺的作用（Kucharski et al.，2007）。目前，表皮蛋白的保守結構域分別有R&R保守結構域、Tweedl基序、44個氨基酸殘基和富含甘氨酸基序等（Guan eta1.，2006；He et al.，2007；Togawa et al.，2007）。劉清明等（2010）、孫汝江（2014）提出昆蟲表皮蛋白按照不同的保守模體可分為CPR、CPT、CPF、CPFL和CPG五大家族，其中CPR家族約占五大家族的70%，是數量最多的一種表皮蛋白。現已在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、家蠶（Bombyx mori）和煙草天蛾（Man-duca sexta）等多種昆蟲基因組發現CPR家族表皮蛋白（趙小明等，2017）。Rebers和Riddiford最先鑒定出CPR家族的R&R保守基序為：G-x（8）-G-x（6）-Y-x（2）-A-x-E-x-G-F-x（7）-P-x-P（數字代表氨基酸的數目）（劉清明等，2010；孫汝江，2014），R&R保守基序是表皮蛋白和幾丁質的結合區域，其對角質層結構起重要作用（唐亮，2010）。在隨后的研究中，學者又根據R&R保守基序的差異將CPR家族分為三個亞族：RR-1亞族、RR-2亞族和RR-3亞族（Soares et al.，2007）。昆蟲表皮蛋白種類繁多，每一種表皮蛋白的功能可因所處昆蟲發育階段及組織的不同而異（梁九波，2012）。赤擬谷盜RR-1型表皮蛋白TcCPR4和TcCP30對赤擬谷盜表皮形成起著關鍵作用（Mun et al.，2015；Noh et al.，2015）。黑腹果蠅表皮蛋白基因TweedleD1的缺失導致幼蟲和蛹的體形變粗短，表明TweedleD1參與了黑腹果蠅體形的塑造（Guan et al.，2006）。馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）通過上調表皮蛋白基因Ld-GRPl、Ld-GRP2和Ld-GRP3的表達量來增加表皮成分以應對環境壓力（Zhang et al.，2008）。昆蟲表皮蛋白主要在昆蟲表皮整合、體型塑造、骨化部位構建、適應環境等方面發揮重要作用（Dittmer et al.，2012）。【本研究切入點】目前，多種昆蟲的表皮蛋白基因已相繼被報道（馬艷等，2013），但有關小菜蛾表皮蛋白基因序列分析和差異表達的研究尚無文獻報道。【擬解決的關鍵問題】采用反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）和快速擴增cDNA末端（RACE）技術擴增小菜蛾表皮蛋白基因（P.xylostella cuticular protein，PxyICP）并進行生物信息學分析，通過熒光定量PCR檢測PxyICP基因的發育表達模式，為進一步探討小菜蛾表皮蛋白的生理功能提供科學參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試小菜蛾來自仲愷農業工程學院昆蟲實驗室，在室內采用盆栽蘿卜苗長期飼養，溫度為（25土1）℃，濕度為70%～80%，光照周期為16L：8D。

主要試劑：RNA Kit I R6834購自廣州飛揚生物工程有限公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，pMD20-T克隆載體、Prime-Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒、ExTaq DNA聚合酶及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）熒光試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2小菜蛾總RNA提取和第一鏈cDNA合成

收集小菜蛾1～4齡幼蟲、蛹及成蟲等不同發育時期材料，取樣后立即將樣品放人液氮中凍存。試驗中嚴格按照RNA試劑盒操作步驟提取小菜蛾總RNA，并用分光光度計和電泳檢測RNA質量合格后，按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒的說明進行操作，反轉產物20℃貯存備用。

1.3引物設計和cDNA擴增

根據課題組前期轉錄測序獲得的小菜蛾表皮蛋白部分基因序列，應用Primer Premier 5.0設計引物ICP-51和ICP-52，結合5′RACE試劑盒中提供的通用引物5′GeneRacer Primer和5′GeneRacer Nested Primer進行巢式PCR，獲得PryICP 5′端cDNA序列。再根據擴增得到的5′端序列測序結果設計特異引物ICP-31進行擴增，得到PxylCP的3′端序列。3′和5′端序列用DNAMAN進行拼接獲得PxylCP的全長cDNA，根據獲得的全長cDNA序列設計1對引物ICP-ORF1和ICP-ORF2，用于PxyICP ORF序列驗證。引物序列信息見表1。PCR反應體系50.00μL：5.00μLDNA聚合酶反應緩沖液，上、下游引物（10 mol/L）各2.00μL，4.00μL dNTP（2.5 mmol/L），0.25μLExTaq DNA聚合酶（5 U/μL），加滅菌超純水補足至50.00μL。擴增程序：94℃預變性3 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，進行33個循環；72℃延伸10 min。5.00μL擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳回收后與pMD20-T載體連接過夜，挑選陽性克隆并PCR鑒定后測序，由廣州英駿生物技術有限公司完成測序。

1.4生物信息學分析

1.4.1 PxylCP序列特性分析 使用DNAStar將克隆獲得的DNA序列翻譯成蛋白質序列；使用SingnalP（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/）預測Pxy-ICP信號肽；利用TMHMMg對PxylCP蛋白進行跨膜運輸分析；使用NetPhos（http：∥www.cbs.dtu.dk/servic-es/NetPhos/）預測PxylCP磷酸化修飾位點；使用Prot-Param（http：∥web.expasy.org/protparam）預測PxyICP的相對分子質量、等電點等；使用ProtScale（http：∥web.expasy.org/prot scale/）對PxylCP進行蛋白質親疏水性分析。

1.4.2系統發育進化樹分析 從NCBI網站（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）分別選取昆蟲綱鱗翅目、半翅目、雙翅目、膜翅目、虱目等共31個物種的昆蟲表皮蛋白序列，與本研究克隆的小菜蛾表皮蛋白序列進行系統發育進化樹分析。使用DNAStar的MegAlign程序，選擇ClustalW的方法構建系統發育進化樹。

1.5 PxyICP基因表達分析

根據cDNA序列信息設計熒光定量特異性引物PxyQF和PxyQR（表2），以actin基因為內參基因（引物為PactF和PactR），無菌超純水為陰性對照，以2Pxy-ICP基因在1齡幼蟲的表達量為標準參量，采用實時熒光定量PCR檢測表皮蛋白基因PxyICP在小菜蛾不同發育時期的表達變化動態。每個樣品重復3次。采用2-^ΔΔCt法計算PxyICP基因的相對表達量。

實時熒光定量PCR體系25.00μL：包含SYBR預混液（TaKaRa Code：RR820）12.50μL，引物（10μmol/L）各1.00μL，cDNA模板2.00μL，滅菌超純水8.50μL。采用兩步法進行PCR擴增：95℃預變性30 s；95℃5 s，60℃30 s，進行40個循環。

2結果與分析

2.1 PxyICP序列特征分析

從反轉合成的小菜蛾cDNA中克隆獲得表皮蛋白基因PxyICP。序列分析可知，PxyICP基因開放閱讀框全長531 bp，編碼177個氨基酸，相對分子質量約18.90 kD，等電點為5.32。PxyICP推導的氨基酸序列如圖1所示。

用ProtScale分}）TPxyICP的親疏水性，結果表明，PxyICP的平均親水性是-80.256，為親水性蛋白。SingnaIP預測結果顯示，PxyICP的氨基末端第1～16位氨基酸是參與跨膜蛋白轉移的信號肽（圖1）。PxyICP的磷酸化修飾位點預測結果顯示，PxyICP的氨基酸序列中分別含有10個絲氨酸、4個酪氨酸和2個蘇氨酸磷酸化位點。將PxyICP的氨基酸序列與3種類型的R&R保守基序進行對比，可發現其與RR-1型保守基序匹配度較高，在保守的幾丁質結合區僅有5個位點的氨基酸發生突變（圖1）。在Prosite數據庫（http：∥prosite.expasy.org/）中，PxyICP被鑒定為RR-1型表皮蛋白，且幾丁質結合區域為第86～111位氨基酸（圖1）。

2.2表皮蛋白的系統發育進化分析結果

為探究表皮蛋白在不同昆蟲問的進化關系，本研究采用DNAStar的MegAlign程序對包括小菜蛾在內的31種昆蟲表皮蛋白進行系統發育進化樹分析。由圖2可知，所選取的31條昆蟲的表皮蛋白序列大致聚為五大類，分別對應雙翅目、鱗翅目、膜翅目、半翅目和虱目昆蟲的序列，較好地反映了物種間的進化關系。在五大類昆蟲中，小菜蛾的表皮蛋白序列與鱗翅目昆蟲的表皮蛋白聚為一類，且小菜蛾表皮蛋白與同屬鱗翅目的金鳳蝶（Papilio machaon Linnae-us）的表皮蛋白遺傳距離最近，屬于同一分支；而與同屬鱗翅目的玉帶鳳蝶（P.polytes）、柑橘鳳蝶（P.xuthus）和煙草天蛾（Manduca sexta）的表皮蛋白親緣關系相對較遠。

2.3 PxyICP基因在小菜蛾不同發育時期的表達

以1齡幼蟲中PxyICP mRNA表達量為標準參量，利用實時熒光定量PCR分析PxyICP基因在小菜蛾不同發育時期中表達量的差異，結果如圖3所示。由圖3可知，PxyICP基因在小菜蛾發育的各個時期均有表達，在1～4齡幼蟲的表達量均較低，在2、3、4齡幼蟲中的表達量分別是1齡幼蟲的243%、51%和63%；在蛹和成蟲中PxyICP的表達量大幅度增加，其在蛹和成蟲中的表達量分別是1齡幼蟲的3.19和12.32倍，其中在成蟲中的表達量最高。

3討論

幾丁質和表皮蛋白是構成昆蟲表皮的主要成分，而CPR家族是昆蟲表皮蛋白五大家族中最大的一個家族，其包括RR-1、RR-2和RR-3等3種亞族。本研究克隆獲得小菜蛾表皮蛋白基因，命名為PxyICP，氨基酸序列分析結果表明該基因編碼的蛋白具有16個氨基酸的信號肽，預測該蛋白可能為分泌型蛋白。PxyICP基因編碼的蛋白具有RR-1保守基序的典型特征[G-x（8）-G-x（6）-Y]，屬于CPR家族中的RR-1亞族，但在保守的幾丁質結合區具有5個氨基酸發生突變。Hamodrakas等（2002）研究證明保守基序中的芳香族氨基酸殘基（主要為酪氨酸Y和苯丙氨酸P）在與幾丁質的結合過程中發揮重要作用。而PxyTICP序列由保守基序中的氨基酸F突變為氨基酸Y，這將可能會加強PxyICP蛋白與幾丁質的相互結合。大部分RR-1型表皮蛋白主要存在于昆蟲幼蟲表皮和節問膜等較軟的角質層中（Noh et al.，2016）；但意大利蜜蜂（Apis mellifera）的RR-1型表皮蛋白AmelCPR14主要與蜜蜂成蟲蛻裂后期表皮的鞣化和變黑有關（Karouzou et al.，2007；Soares et al.，2007）。家蠶RR-1型表皮蛋白基因BmorCPR2的缺失致使家蠶幼蟲節間褶增長和節問顯著隆起而導致畸形（Qiao et al.，2014）。

表皮蛋白基因在昆蟲不同發育時期的表達具有一定特異性。褐飛虱的表皮蛋白基因NlICP在3齡幼蟲期表達量最高，而在成蟲期幾乎不表達，NlICP與褐飛虱若蟲表皮的發育及蛻變有關（馬艷等，2013）。西方蜜蜂表皮蛋白基因AmelTwdll和AmelT-wdl2在成蟲中的表達量最高（Soares et al.，2011）。岡比亞按蚊CPF表皮蛋白家族基因CPFL2-7基因在幼蟲期高表達，表明其可能參與幼蟲表皮的形成（Togawa et al.，2007）。本研究對PxyICP基因的發育表達模式分析結果表明，PxylCP基因在小菜蛾不同發育時期均有表達，但在成蟲期表達量最高，暗示PxyICP基因可能與小菜蛾成蟲蛻變后期表皮的硬化變黑或與成蟲形成特殊表皮抵御外界不良環境等生理功能有關。因此，以表皮蛋白PxyICP為靶標開展小菜蛾防治研究，即有可能抑制小菜蛾的正常生長發育和提高現有殺蟲劑的毒殺效果而達到有效控制小菜蛾的最終目的。

4結論

本研究克隆了小菜蛾PxyICP基因，該基因序列具有昆蟲表皮蛋白CPR家族中RR-1型保守基序的典型特征。不同發育時期的實時熒光定量PCR分析結果表明，PxyICP在小菜蛾各發育時期均有表達，但在成蟲中的表達量最高，推測PxyICP蛋白參與小菜蛾成蟲表皮的硬化和黑化等生理過程。