納米羥基磷灰石對卵巢癌細胞株的抑制作用研究

韓麗麗 張慧慧 馬慧芳 付莉

【摘要】目的研究納米羥基磷灰石（nHAP）對卵巢癌細胞株SKOV3生長的影響及其作用機制。方法培養卵巢癌SKOV3細胞，分別計算出nHAP對卵巢癌SKOV3細胞的30%、50%、70%抑制濃度（IC30、IC50、IC70），繪制量效曲線和時效曲線。選用IC50的nHAP作用卵巢癌SKOV3細胞48 h，與無nHAP的對照組卵巢癌SKOV3細胞對比，分別進行透射電鏡觀察、流式細胞儀檢測。結果 nHAP作用48 h后，不同濃度nHAP對卵巢癌SKOV3細胞均表現出抑制作用，nHAP對卵巢癌SKOV3細胞的IC30、IC50、IC70分別為946、2883、6080 mg/L。IC30、IC50、IC70的nHAP作用于卵巢癌SKOV3細胞 48 h期間，抑制率隨時間延長而升高，48 h后抑制率增速變緩。形態學觀察和定量分析顯示IC50的nHAP作用卵巢癌SKOV3細胞48 h可誘導其凋亡，其凋亡率為（4332±1253）%，對照組為（1088±548）%，組間比較差異有統計學意義（P<005），且與對照組比較，IC50的nHAP作用下的卵巢癌SKOV3細胞G0/G1期百分比高、S期細胞百分比低（P均<005）。結論nHAP對卵巢癌細胞株SKOV3的生長具有明顯的抑制作用，其機制可能是nHAP作用于卵巢癌SKOV3細胞的S期，誘導腫瘤細胞凋亡。

【關鍵詞】納米羥基磷灰石；卵巢癌；細胞株

Effect of nanoscale hydroxyapatite on ovarian cancer cell lineHan Lili， Zhang Huihui， Ma Huifang， Fu Li Department of Obstetrics and Gynecology， the Second Hospital of Jilin University， Changchun 130041， China

Corresponding author， Fu Li， Email：doctorfuli@sinacom

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of nanoscale hydroxyapatite （nHAP） upon the growth of ovarian cancer cell line SKOV3 MethodsThe ovarian cancer cell line SKOV3 was cultured The 30%， 50% and 70%inhibitory concentrations （IC30， IC50 and IC70） of nHAP upon the ovarian cancer cell line SKOV3 were calculated， and the doseeffect and timeeffect curves were delineated The SKOV3 cells treated with IC50 of nHAP and those untreated with nHAP were prepared for transmission electron microscopic observation and flow cytometry detection ResultsAfter nHAP treatment for 48 h， different concentrations of nHAP could inhibit the growth of ovarian cancer SKOV3 cells The IC30， IC50 and IC70 of ovarian cancer SKOV3 cells were calculated as 946， 2883 and 6080 mg/L， respectively During the 48h period of different concentrations of nHAP treatment， the inhibitory rate was elevated over time and remained slow and stable after 48 h Morphological observation and quantitative analysis demonstrated that 48h treatment with IC50 of nHAP could induce the apoptosis of ovarian cancer SKOV3 cells with a apoptosis rate of （4332±1253）%， significantly higher compared with （1088±548）% in the control group（P<005） Compared with the control group， the percentage of SKOV3 cells at G0/G1 phase was significantly higher， whereas the proportion of SKOV3 cells at S phase was considerably lower after treatment with IC50 of nHAP（both P<005） ConclusionsnHAP exerts significant effect upon suppressing the growth of ovarian cancer cell line SKOV3 The underlying mechanism is probably that nHAP affects the ovarian cancer SKOV3 cells during the S phase and induces the apoptosis of cancer cells

【Key words】Nanoscale hydroxyapatite； Ovarian cancer； Cell line

羥基磷灰石（HAP）的主要成分為鈣和磷，因其生物相容性作用，常被用作骨修復生物材料[1]。近年研究報道，納米HAP（nHAP）本身也具有抑制結腸癌、肝癌細胞的作用[27]。目前筆者尚未見nHAP對卵巢癌細胞的作用及相關機制研究，為此本研究觀察了nHAP對卵巢癌細胞株SKOV3的生長抑制作用，并進一步深入探討其機制，現報告如下。

材料與方法

一、材料

卵巢癌細胞株SKOV3由吉林大學第二醫院婦科實驗室提供。RPMI 1640培養基、小牛血清、碘化丙啶（PI）、胰酶、MTT選自美國Sigma公司，其余試劑均選自國產分析純。nHAP長約60～80 nm，半徑約5～10 nm。

二、方法

1卵巢癌SKOV3細胞的培養

適宜條件下于含小牛血清的RPMI 1640培養基中培養卵巢癌SKOV3細胞，隔日換液，按1∶3的比例傳代。

2卵巢癌SKOV3細胞在nHAP中的生長情況檢測

將nHAP用培養液配成 10種梯度濃度（10、20、50、100、150、200、250、300、350、400 mg/L），選對數期生長的卵巢癌SKOV3細胞進行試驗。接種于96孔板，孵箱培養24 h后棄培養液，分別加入調配好的10種梯度濃度nHAP液，對照組為等量卵巢癌SKOV3細胞加等量培養液，每濃度設8復孔，48 h后每孔再加5 g/L的MTT 20 μl，繼續培養4 h。吸凈液體后每孔加入150 μl二甲亞砜。均勻搖動10 min，酶標儀測OD450值（OD值）。計算nHAP作用下的細胞抑制率，繪制量效曲線，并分別計算出nHAP 對卵巢癌SKOV3細胞的30%、50%、70%抑制濃度（IC30、IC50、IC70）。同法接種96孔板，24 h后棄培養液，此時分別加入IC30、IC50和IC70的nHAP，培養24、48、72、96、120、144 h時，MTT法檢測細胞抑制情況，試驗重復3次，結果取平均值。繪制這3種濃度nHAP下卵巢癌SKOV3細胞生長的時效曲線。細胞存活率（%）=（試驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%；細胞抑制率（%）=1-（試驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%[4]。

3nHAP作用后卵巢癌SKOV3細胞的形態觀察

48 h后收集對照組和IC50的nHAP作用下的卵巢癌SKOV3細胞（試驗組），戊二醛固定，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，1%OsO4再固定，PBS再清洗。脫水后以Epon812樹脂包埋3 h，切片、雙重染色后用透射電子顯微鏡觀察。

4細胞周期分析

流式細胞儀檢測各組細胞周期的比例，用Sub G1峰法分析各組細胞的凋亡率。

三、統計學處理

采用SPSS 190處理數據，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以百分率表示。P<005為差異有統計學意義。

結果

一、nHAP作用于卵巢癌SKOV3細胞的量效曲線

nHAP作用48 h后，10種不同濃度nHAP對卵巢癌SKOV3細胞均表現抑制作用，見圖1。當nHAP濃度≤100 mg/L時，抑制率隨濃度增高而增高。當HAP濃度>100 mg/L后，抑制率增加速度變緩。nHAP對SKOV3的IC30、IC50、IC70分別為946、2883、6080 mg/L。

圖1nHAP作用于卵巢癌SKOV3細胞48 h的量效曲線

二、nHAP作用于卵巢癌SKOV3細胞的時效曲線

IC30、IC50、IC70的nHAP作用卵巢癌SKOV3細胞48 h期間，抑制率隨時間延長而升高，48 h后抑制率增速變緩，見圖2。

三、nHAP對卵巢癌SKOV3細胞形態學影響

1光鏡下細胞形態

光鏡下，對照組卵巢癌SKOV3細胞呈貼壁生長，呈略圓形或多角形，核較大，多為單核，可見較多核分裂相。與對照組相比，經IC50 nHAP作用48 h的試驗組SKOV3細胞密度降低，細胞間隙增寬，且形態不規則，核分裂相減少，見圖3。

與無nHAP的對照組卵巢癌SKOV3細胞對比，試驗組G0/G1期百分比高，S期細胞百分比低，2組間比較差異有統計學意義（P均<005），2組G2/M期細胞百分比比較差異無統計學意義（P>005）。試驗組凋亡率高于對照組（P<005），見表1。

討論

1992年Hideki等采用液相沉淀法合成納米羥基磷灰石微晶體，并意外發現HAP微晶體對Ca9表1IC50的nHAP對卵巢癌SKOV3細胞周期和凋亡率的影響（±s）%組別例數細胞周期G0/G1期S期G2/M期凋亡率對照組106065±5722598±4541337±6551088± 548試驗組106833±4001893±2711273±3484332±1253t值3479421702737501P值000300010789<0001腫瘤細胞的增殖也有明顯的抑制作用。在隨后的研究中發現HAP納米粒子對多種腫瘤細胞的生長均有抑制作用[27]。

本研究顯示，nHAP能抑制卵巢癌SKOV3細胞生長，當nHAP≤100 mg/L時，nHAP對卵巢癌SKOV3細胞的抑制率隨濃度增高而增高，而IC30、IC50、IC70的nHAP在48 h內對卵巢癌SKOV3細胞的抑制率隨時間延長而升高，表明48 h內為其敏感期。

目前尚未明確nHAP對腫瘤細胞的抑制機制，本研究為了探討nHAP抑制卵巢癌SKOV3細胞生長的機制，首先對SKOV3 細胞進行了形態學觀察，發現試驗組細胞呈凋亡形態學改變，胞核和胞漿內有大量的nHAP，因此考慮為nHAP體積小，可通過胞膜、核膜引起DNA損傷，導致細胞凋亡。有學者認為，nHAP非特異性的吞噬能力與黏附能力密切相關。納米級材料具有較大的表面能，與非nHAP相比更容易被腫瘤細胞所吞噬[89]。

本研究還通過流式細胞儀定量分析了對照組與試驗組的細胞周期所占比例和凋亡率。在細胞周期中，正常情況下細胞一旦進入S期、開始合成DNA，就會不間斷地、有順序地通過細胞的各個周期，完成細胞分裂，直至G1期，因此細胞的增殖通常是由DNA合成開始所控制的。本研究顯示，用藥組的S期細胞明顯少于對照組，而G0/G1期細胞多于對照組，因此我們認為nHAP作用于卵巢癌SKOV3細胞的S期，使其凋亡，不能達到G2期，最終不能完成細胞分裂和增殖。

綜上所述，nHAP有抑制卵巢癌細胞株SKOV3生長的作用，其機制可能是nHAP作用于卵巢癌SKOV3細胞的S期，誘導腫瘤細胞凋亡。參考文獻

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（收稿日期：20170605）

（本文編輯：林燕薇）