紫花苜蓿雄性不育機理及其應用

張世超 王英哲 王志鋒 金艷 陳晶晶 徐博

摘要闡述了紫花苜蓿雄性不育性的概況、紫花苜蓿的細胞質雄性不育的分子機理及雄性不育系國內外應用研究進展，并展望了紫花苜蓿今后的研究趨勢。

關鍵詞紫花苜蓿；雄性不育系；不育機理

中圖分類號S541+.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）11-0096-03

AbstractWe summarized the overview of alfalfa male sterility，molecular mechanism of cytoplasm male sterility and male sterile lines application research progress at home and abroad briefly，and put forward alfalfa development trend in the future.

Key wordsAlfalfa；Male sterile line；Sterile mechanism

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）最初從伊朗傳入各國，歷史久遠，無論在其他國家還是我國，都是被廣泛種植應用的優良牧草，且是種植面積較大的人工牧草。紫花苜蓿因其產量高、蛋白質含量豐富、營養價值高、草種品質優良，被稱為“牧草之王”。紫花苜蓿只能異花授粉，自交結實率低，需要采用雜交方式來生產種子。紫花苜蓿有著很強的雜種優勢，但若要在生產中大規模利用紫花苜蓿的雜種優勢，則需要建立一套高效、安全的授粉控制系統，而雄性不育是紫花苜蓿利用雜種優勢的重要途徑之一。紫花苜蓿的雄性不育也是蝶形花亞科植物花器官分化及發育的良好材料，倍受各國學者的重視[1-3]。目前，我國對品質優秀的豆科牧草需求量逐年增加，利用雄性不育特性獲得雜種優勢是培育優質苜蓿品種及其雜交制種的最有效方式[4-5]。紫花苜蓿雄性不育系的開發為苜蓿育種做出了重要貢獻，在農業生產上是一種既經濟又可以提供充足F1代種子的可行方法。

雄性不育的遺傳機理近幾年引起研究苜蓿的育種專家的廣泛關注。在對紫花苜蓿繁殖特性的階段性改良、種子產量的提高和雜種優勢的利用等研究中，紫花苜蓿雄性不育系的獲得及遺傳分析是不可或缺的，是紫花苜蓿雄性不育遺傳機理研究的前提和基礎。鑒于此，筆者綜述了紫花苜蓿雄性不育性的概況、紫花苜蓿的細胞質雄性不育的分子機理及雄性不育系國內外應用研究進展，并展望了紫花苜蓿今后的研究趨勢，旨在為紫花苜蓿遺傳育種研究提供參考。

1植物雄性不育的研究概況

植物在每一個階段的進化發展中，都會有多種多樣的育性變異在發生，其中包括雄性不育、自交不親和等，人們在植物改良上取得的重要進展離不開對這些變異的利用。在1763年，雄性不育的現象就被Kolreuter初步觀察發現。1876年，Coleman使人們接受“植物雄性不育”的觀點并開始使用[6]。造成植物雄性不育現象的原因是多種多樣的，無論是環境的惡劣還是疾病的發生或者基因的突變都可能成為雄性不育現象形成的因素。因為人們無法準確找到雄性不育現象發生的具體原因，從而導致不確定性較多，所以不同的雄性不育材料的表現形式也是多種多樣的。

1.1雄性不育的概念雄性不育是在兩性花中才會發生的現象，主要表現為雄器官退化、產生畸形或者功能喪失，影響了其花藥、花粉及雄配子的正常形成與發育[7]。迄今為止，雄性不育的發現和應用在植物界已經非常常見，植物界有43科162屬617種均發現有雄性不育現象[8]。雄性不育系作為遺傳育種研究應用中的主要資源，歸因于其同時擁有自然條件下的生殖潛質和栽培狀況下的育種價值。在發現不育系之前，對于異花授粉和自花授粉作物，人工去雄、化學殺雄等方法是得到雜交種的常見手段，但這樣的方法生產成本高、勞資投入大，并沒有被廣泛應用。而運用不育系做母本所得到的雜交種種子，不僅使授粉和雜交過程簡單化，降低了成本，而且提高了雜交種種子產量和制種效率，并使雜交種的產量得到了保證，不育系雜交種制種技術也因此正式走入人們的視線。對于花器小和雌雄同花的植物來講，利用雄性不育系這一雜種優勢是最優選擇。目前，隨著育種專家對植物雄性不育機理的深入探究，通過雄性不育系獲得雜交種的方式必將成為雜種優勢利用的主要方式。

1.2雄性不育的類型Sears因雄性不育材料基因型之間的不同表現，將雄性不育分為3類，即細胞質不育型、細胞核不育型和質核互作不育型，即“三型學說”[9]。Edwardson將“三型學說”修改為“二型學說”，即核不育型（GMS）和核質互作不育型（CMS）2類[10]。核質互作不育型也被稱為細胞質雄性不育。

GMS通常受單基因的調控，不育基因的轉化容易，所以它的優點是不育性相對穩定，但由于找不到相應的保持系，從而限制了其在生產制種中的應用。CMS的不育性是由不育的細胞質基因和相對應的核基因所決定的，比較容易找到保持系并進行“三系”配套，在生產應用上前景廣闊。CMS在雜交育種上的成功很大程度歸因于其育性恢復能力，在雜交過程中，當它與攜帶顯性恢復基因的父本雜交時，就可恢復其部分育性。這在雜交育種上是十分重要的，但是大部分雄性不育系，其育性恢復能力的遺傳結構尚不明確。

2紫花苜蓿的細胞質雄性不育的分子機理

國內外研究學者均普遍認為線粒體基因組決定了高等開花植物胞質雄性不育花粉敗育的特征，并且受到核育性恢復基因（Rf）抑制或互作[11]。線粒體的功能是依賴于核基因組和線粒體基因組共同作用的，線粒體基因組的重排、突變以及線粒體基因的剪切、編輯都可能引起細胞質雄性不育[12]。線粒體基因恢復育性則依賴于核基因，核基因干擾了與CMS相關線粒體基因的功能；核基因組中存在CMS育性恢復基因，顯性抑制CMS的表現[13-16]。

近年來，序列相關擴增多態性（SRAP）、簡單序列重復區間（ISSR）、擴增片段長度多態性（AFLP）、簡單重復序列（SSR）等分子標記技術不斷被成功應用于植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建和基因定位研究。而利用分子標記對植物細胞質雄性不育基因及其核恢復基因的分析和定位方面的研究也較多。Zhou等[17]用SSR分子標記將T型恢復基因定位到1B染色體上。劉保申等[18]采用SSR分子標記方法對其恢復系的恢復基因進行尋找，對這個恢復基因進行染色體定位后發現與4個SSR引物擴增位點有連鎖關系，后計算出它們相應的遺傳距離，這個發現對K型小麥細胞質雄性不育系恢復基因的標記輔助選擇應用有重要意義。Sinha等[19]利用SSR標記對小麥的F2代分離群體進行遺傳分析，并確定了Rf8的染色體定位并對該基因進行了精細定位。劉金兵等[20]利用ISSR分子標記對甜椒的不育系和保持系進行分子標記，篩選到了與甜椒細胞質雄性不育基因連鎖的分子標記。張春寶等[21]利用大豆線粒體DNA開發了細胞質雄性不育材料的SCAR標記，并用于大豆細胞質不育系的篩選和不育系種子純度鑒定，也進一步證明了植物中細胞質雄性不育花粉敗育的特征是由線粒體基因組決定的。

關于紫花苜蓿細胞質雄性不育的恢復基因對其育性產生的影響是如何通過線粒體-核基因互作達到的，目前還處于初步研究階段，因此迫切需要根據已有材料對紫花苜蓿細胞質雄性不育的恢復基因進行定位分析，為紫花苜蓿細胞質雄性不育恢復基因的精細定位、克隆和功能分析提供參考，進而為了解這一復雜的分子過程提供直接或間接的理論依據。

3紫花苜蓿雄性不育系應用的研究現狀

3.1國外應用研究現狀1958年加拿大學者首次發現了紫花苜蓿雄性不育株20DRC[22]，然后找到了相對應的恢復系和保持系，配制雜種后F1代的飼草產量高出對照30%以上[23]，美國、俄羅斯、匈牙利、保加利亞、法國等國的學者也相繼培育出紫花苜蓿雄性不育系植株，并通過無數的雜交試驗得到了良好的雜交種[24]。人們對苜蓿雄性不育系的基礎理論研究是在20世紀80年代，英國、俄羅斯等國學者比較了苜蓿雄性不育系的不育和可育花粉的基因型[25]，分析了其不育類型和機制[26]。在不育系的繁育研究方面，Tereshchenko等[27]最早發現了紫花苜蓿細胞質雄性不育系的保持系，并組配雜交組合檢驗后代育性恢復狀況，使得不育系種子的大量獲得成為可能。Rosellini等[28]采取了轉基因的方式，成功培育出紫花苜蓿雄性不育植株，同時對其不育系的細胞學機理和相應的遺傳分析兩方面進行新的探究 。但由于紫花苜蓿屬于異花授粉植物，不育系無花粉，不能吸引昆蟲傳粉，使得雜種優勢的利用和種子生產上也存在一些問題[29]。美國Dairyland種子公司利用其掌握的紫花苜蓿細胞質雄性不育系和保持系，于2001年最早推出了紫花苜蓿雜交種，并陸續推廣上市了多個紫花苜蓿雜交種，研究顯示紫花苜蓿雜交種在產量、抗旱性、整齊性等方面都有著非常優良的表現[30]。這一成功經驗表明了利用紫花苜蓿細胞質雄性不育系培育和繁育雜交種的可行性，為我國紫花苜蓿雜交品種的選育工作指明了方向。但是針對紫花苜蓿細胞質雄性不育的理論研究仍然較少，這是由于雜交種的生產涉及到一些商業秘密，從而限制了對其更加深入的探索。

3.2國內應用研究現狀與國外相比，我國對苜蓿雄性不育系的研究相對較晚，1978年吳永敷教授從草原一號雜花苜蓿（Medicago varia Martin.cv.‘Caoyuan No.1）中選育出3個部分不育株和3個完全不育株[31]。有學者于1986年通過對細胞減數分裂過程的研究，在Ms-4植株和9個苜蓿品種的測交試驗中發現F1代群體中的雄性不育比例在2%～10%[32]。不育系MS-4植株屬完全不育類型，遺傳性狀穩定，適合育種生產。隨后，用不育系Ms-4和40個優良苜蓿品種雜交[33]，篩選出的高產組合，和對照品種相比產量平均增加25.8%[34]。自1998年以后，石鳳翎等[35]開始對苜蓿雄性不育系展開了更深入的研究。通過分析苜蓿雄性不育系及其F1代不同時期葉子和花朵的同工酶發現，不育系Ms-4與可育系相比較，無論是酶帶數量、酶活性等都存在差異，但由于雜種優勢并不是在任何時期都能用同工酶檢測到，所以在某些時期沒有出現優勢酶。學者們在對苜蓿雄性不育系的生殖生物學、花蕊細胞形態學和花蜜腺解刨學進行研究后[36-37]，為改善不育系花序短小、蜜腺分泌物少等不良生殖性狀，曾運用多次回交轉育法得到育性分離后的不育株，建立相對穩定的苜蓿雄性不育系，發現不育植株的幼嫩莖段、葉片、葉柄可以作為誘導愈傷組織的外植體，從而找到了保存和繁殖不育系的方法[38]；通過PARD技術，獲得了1個與苜蓿雄性不育系相關的分子標記，探索了苜蓿雄性不育性的分子鑒定方法，篩選到與苜蓿雄性不育性相關的基因片段，并利用它得到了3個F1代不育系植株，14個回交一代不育系植株[39]。

雖然我國學者對紫花苜蓿雄性不育系進行了較多研究，但多集中在細胞核不育機理方面，這對紫花苜蓿雜交新品種的選育工作推動不大。于洪柱等[40]于2008年在公農1、2、3號紫花苜蓿衛星搭載后代中發現了紫花苜蓿雄性不育材料的新成員（MS-GN），不育特性表現為無花粉或花粉敗育。目前已獲得穩定的紫花苜蓿雄性細胞質不育材料4份，利用測交、回交方法，初步選育出3份對細胞質不育性保持穩定的保持系育種材料，后代不育率均高于95%，有廣闊的理論研究和應用價值，為進一步對苜蓿雄性不育系的利用提供了有效的前提條件。

4苜蓿雄性不育系今后的研究趨勢

紫花苜蓿在產量上取得重要突破的途徑之一就是利用雜種優勢，國外的研究表明利用紫花苜蓿的細胞質不育系、保持系和恢復系進行“三系”配套，輔以相應的制種方法，進行商業制售雜交種是可行的。

盡管目前紫花苜蓿不育系的相關研究較多，但在紫花苜蓿細胞質不育的研究方面仍存在一些問題。在國際上，相關研究多集中于不育系多態性片段分析上，在對紫花苜蓿細胞質不育的機理、核質互作機制方面研究不足，而國內由于紫花苜蓿細胞質雄性不育材料的缺乏，相關研究多集中于細胞核雄性不育機理方面；缺乏系統的研究紫花苜蓿細胞質雄性不育的遺傳基礎和遺傳模式，使得進一步研究紫花苜蓿細胞質雄性不育恢復機制缺乏理論基礎；雖然群體分離分析法的發展、植物的細胞質雄性不育恢復基因的定位和克隆技術的進步及高質量紫花苜蓿的遺傳圖譜的構建都為紫花苜蓿的細胞質雄性不育恢復基因的克隆提供了依據，但缺乏對于紫花苜蓿核質互作不育這一復雜分子過程的理論依據，所以仍需要對紫花苜蓿細胞質雄性不育恢復基因的定位、克隆和功能分析等進行大量研究。

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