褐紋報春苣苔組織培養與快速繁殖

閆海霞　鄧杰玲　黃昌艷　關世凱　何荊洲　張自斌　卜朝陽

摘要： 褐紋報春苣苔（Primulina glandaceistriata）是一種極具觀賞價值的喀斯特地區野生花卉，目前尚未有褐紋報春苣苔組培快繁的研究報道。該研究以褐紋報春苣苔的葉片為外植體，通過兩種途徑建立其組培快繁體系。結果表明：適宜的不定芽誘導培養基為MS+6BA 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1，適宜的不定芽增殖培養基為MS+ZT 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1+活性炭 0.05 g·L1，增殖系數為11.09；適宜的愈傷組織誘導培養基為MS+TDZ 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1，適宜的愈傷組織分化培養基為MS+ZT 1.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1，分化系數為12.46；適宜的生根培養基為1/2MS+IBA 0.1 mg·L1+活性炭0.05 g·L1或1/2MS+IBA 0.5 mg·L1+活性炭0.05 g·L1，生根率為100%。該研究結果成功建立了褐紋報春苣苔的組培快繁體系，為今后褐紋報春苣苔的種苗繁殖和遺傳轉化提供了技術支持。

關鍵詞： 苦苣苔， 褐紋報春苣苔， 組織培養， 不定芽， 愈傷組織

中圖分類號： Q943.1

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）10127009

褐紋報春苣苔（Primulina glandaceistriata）是苦苣苔科（Gesneriaceae）報春苣苔屬（Primulina）的多年生草本植物，本種在廣西靈川縣首次發現。該種的主要特征是葉片具有棕色的條紋，花朵形態美麗，四季常綠，是極具觀賞價值的喀斯特地區野生花卉。目前尚未有褐紋報春苣苔的相關研究報道，對其物種保護十分不利。褐紋報春苣苔的繁殖可以采用種子播種或葉片扦插的方法，但種子細小不易收集，采種繁瑣，扦插繁殖系數小，出芽時間長，不利于人工繁殖的規模化。離體快繁具有繁殖系數大、繁殖時間短的優點，是人工繁育種苗的極佳手段，也是種質資源保存重要手段，如張占江等（2014）利用離體培養的方法對弄崗報春苣苔進行了保存。

離體快繁的途徑有不定芽途徑和愈傷組織誘導途徑。這兩種途徑在苦苣苔科報春苣苔屬的其他植物上已有報道，其中以不定芽途徑的相關報道較多，侯娜等（2015）以荔波報春苣苔的葉片為外植體，通過不定芽途徑獲得了再生植株，付傳明等（2015）以條葉報春苣苔的葉片為外植體，通過不定芽途徑建立了其離體快繁體系，潘梅等（2014）通過不定芽途徑成功建立了煙葉報春苣苔的再生繁殖體系，張占江等（2013）以條葉報春苣苔的葉片、種子為外植體，建立了條葉報春苣苔的組織培養和再生體系。盡管苦苣苔的組培研究逐年增多，但關于褐紋報春苣苔的組培研究并未見有報道。本研究以褐紋報春苣苔的葉片為材料，通過不定芽途徑和愈傷組織誘導途徑建立其高效穩定的組培快繁體系，為褐紋報春苣苔的物種保育和遺傳轉化提供理論和技術基礎。

1材料與方法

1.1 材料

經人工馴化的褐紋報春苣苔成熟植株，由廣西壯族自治區農業科學院花卉研究所提供。

1.2 培養基及培養條件

以MS為基本培養基，以培養目的添加不同種類和濃度的植物生長調節劑，白砂糖為30 g·L1，瓊脂為6.0 g·L1，pH 5.8～6.2（生根培養用1/2MS為基本培養基，其大量元素和白砂糖為MS培養基中的1/2，其余成分的含量和MS培養基保持一致），配制分裝后，于121 ℃滅菌25 min。冷卻后接種，在溫度（28 ± 1） ℃、光照強度2 000 lx、光照時間14～16 h·d1的條件下培養。

1.3 外植體的滅菌

春季取健康植株的幼嫩葉片，洗衣粉浸洗10 min，再在流水下沖洗0.5 h，然后轉移到超凈工作臺進行滅菌的操作。先用棉球蘸取75%酒精溶液拭擦葉片的正反兩面，無菌水沖洗5次；再將葉片在75%酒精溶液中浸泡10～12 s，無菌水沖洗5次；最后將葉片在0.1%升汞溶液中浸泡10 min，無菌水沖洗5次。滅菌過程中，輕輕震蕩使葉片充分接觸溶液。滅菌結束后，將葉片切成1 cm × 1 cm大小，按照葉面朝上、葉背朝下的方式平鋪接入不同的培養基中（圖1：A）。

1.4 不定芽誘導及增殖

1.4.1 不定芽誘導將葉片接入培養基中。每種培養基接種葉片30片，3次重復。培養30 d及60 d后，統計從葉片直接誘導出不定芽的數量，計算不定芽誘導率：不定芽誘導率=產生不定芽葉片數/接種數×100%。

1.4.2 不定芽增殖將獲得的不定芽接入增殖培養基中。每種培養基接種不定芽30株，3次重復。培養30 d后計算增殖系數：增殖系數=新芽數/接種芽數。

1.5 愈傷組織誘導及分化

1.5.1 愈傷組織誘導將葉片接入培養基中。每種培養基接種葉片30片，3次重復。培養30 d及60 d后，統計從葉片直接誘導出的愈傷組織數、不定芽數以及愈傷分化出的不定芽數，計算愈傷組織誘導率。

愈傷組織誘導率=產生愈傷組織的葉片數/接種數×100%。

1.5.2 愈傷組織分化培養將獲得的愈傷組織接入愈傷組織分化培養基中。每種培養基接種愈傷組織30塊，3次重復。培養30 d后統計新芽分化系數。

分化系數=分化新芽數/接種數。

1.6 生根培養與煉苗移栽

將具有4片以上葉片的小苗接入生根培養基中進行生根誘導培養。每種培養基接種小苗30株，3次重復。培養30 d后統計產生根的植株數量，并對根長、根條數進行記錄，計算生根率。

待植株生根后，將具有6片以上葉片、根數7條以上、根長3 cm以上的組培瓶苗放置溫室中煉苗5～7 d后在溫室中進行移栽，移栽基質為泥炭混合珍珠巖（體積比為2∶1），20 d后統計移栽成活率。

1.7 統計分析

采用Excel 2003軟件進行統計處理，采用SPSS 19.0軟件進行方差分析以及Duncans 多重比較。小寫字母表示差異達到顯著水平（P<0.05）。

2結果與分析

2.1 不定芽以及愈傷組織的誘導

2.1.1 不定芽的誘導從表1可以看出，在30 d的培養時間內，添加6BA的培養基可從葉片直接誘導出不定芽，但無愈傷組織形成。在相同的NAA濃度下，不定芽率及不定芽數隨著6BA濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，當6BA濃度為2.0 mg·L1時，不定芽率以及不定芽數為最高；在相同的6BA濃度下，不定芽率以及不定芽數隨著NAA濃度的增加而增加，當NAA濃度為1.0 mg·L1時， 不定

芽率以及不定芽數最高。在60 d的培養時間內，在各培養基上無愈傷組織產生，各培養基之間的不定芽誘導率無顯著差異，均為100.00%，不定芽數以培養基MS+6BA 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1的最多。綜上可知，6BA結合NAA可直接從葉片誘導出不定芽（圖1：B），不能直接誘導出愈傷組織，因此，適宜的不定芽誘導培養基為MS+6BA 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1。

2.1.2 愈傷組織的誘導從表2可以看出，在30 d的培養時間內，添加了TDZ的培養基可從葉片直接誘導出愈傷組織，但無不定芽產生。在相同的NAA濃度下，愈傷誘導率隨著TDZ濃度的增加呈現先上升后下降的趨勢，當TDZ濃度為2.0 mg·L1時，愈傷誘導率最高；在相同的TDZ濃度下，愈傷誘導率隨著NAA濃度的增加而增加，當NAA濃度為1.0 mg·L1時，愈傷誘導率最高。在60 d的培養時間內，各培養基的愈傷誘導率無顯著差異，均為100%。此外，未獲得從葉片直接誘導出的不定芽數，但獲得了從愈傷組織分化出的不定芽，且各培養基之間的由愈傷組織分化出來的不定芽數具有顯著差異，以培養基為MS+TDZ 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1的不定芽最多，顯著高于其他培養基。綜上可知，TDZ結合NAA可從葉片誘導出愈傷組織（圖1： C）， 不能直接誘導出不定芽，隨著培養時間的增加，可從愈傷組織分化出不定芽，因此，適宜的愈傷組織誘導培養基為MS+TDZ2.0 mg·L1+NAA0.10 mg·L1。

2.2 不定芽增殖培養

由表3可以看出，在培養基上附加不同濃度的植物生長調節劑對不定芽的增殖培養具有不同的影響。增殖系數隨著KT和NAA濃度的增加而增加，同時，增殖系數也隨著ZT和NAA濃度的增加而遞增，當ZT為2.0 mg·L1、NAA為0.10 mg·L1，增殖系數最大，為11.09；當NAA的濃度相同時，ZT處理組增殖系數顯著高于KT處理組增殖系數。因此，ZT更有利于褐紋報春苣苔的不定芽增殖，適宜褐紋報春苣苔不定芽增殖培養的培養基為MS+ZT 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1+活性炭0.05 g·L1，增殖系數為11.09，在此培養基上，植株生長好，無玻璃化（圖1：D）。

2.3 愈傷組織的分化

由表4可知，隨著植物生長調節劑濃度的增加，愈傷組織的分化系數隨之增加，并在達到一定濃度后下降，即在一定的NAA或IAA濃度下，隨著ZT濃度的增加，分化系數先增加后減少，但變化不顯著；在一定的ZT濃度下，隨著NAA或IAA濃度的增加，分化系數也呈現出先增加后減少的趨勢。此外，添加NAA培養基的分化系數的顯著高于添加IAA培養基的分化系數，當ZT濃度為1.0 mg·L1，NAA濃度為0.10 mg·L1時，分化系數最大（圖1：E），而添加IAA的培養基，分化得到的植株長勢差，玻璃化嚴重。綜上可知，生長素中，NAA較IAA更適于褐紋報春苣苔的愈傷組織分化，適宜的分化培養基為MS+ZT1.0 mg·L1+NAA0.10 mg·L1，分化系數為12.46，植株長勢好，苗健壯，無玻璃化。

2.4 生根培養與煉苗移栽

2.4.1 生根培養根據表5的數據進行方差分析可知，隨著生長素濃度的增加，生根率隨之增加，但增加不顯著。在1/2MS的培養基上附加IBA濃度為0.10 mg·L1和0.50 mg·L1時，生根率最大，為100%，平均根長無顯著差異，平均根數存在顯著差異，但植株的生長都健壯。因此，適宜褐紋報春苣苔生根的培養基為1/2MS+IBA 0.1 mg·L1+活性炭0.05 g·L1或1/2MS+IBA 0.5 mg·L1+活性炭0.05 g·L1，生根率為100%，植株健壯，根長，根多，有利于后期的移栽成活（圖1：F、G）。

2.4.2 煉苗移栽移栽好的褐紋報春苣苔應放置在遮陰處，保持空氣濕度在75%以上，早晚澆水，保持基質濕潤，20 d后，統計成活率，為100.00%（圖1：H）。

3討論與結論

植物生長調節劑是組培快繁的重要影響因子，不同種類的植物生長調節劑對外植體生長和分化的作用不同，同種植物生長調節劑濃度不同，其作用也有差異，因此，對外植體的脫分化、生長和分化有關鍵作用的是植物生長調節劑濃度的配比。本研究在葉片的初代誘導中采用了兩種不同的細胞分裂素結合同一種生長素進行誘導，發現6BA結合NAA，僅能誘導不定芽而不能誘導愈傷組織，TDZ結合NAA僅能誘導愈傷組織而不能誘導不定芽，初代培養后期獲得的不定芽是由愈傷組織分化得到的。這與前人的結果有所不同：譚曉風等（2009）在進行莨山唇柱苣苔組培快繁時，以6BA 1.0 mg·L1結合NAA 0.5 mg·L1獲得較好的愈傷組織；文弢等（2016）則認為TDZ對大苞短毛唇柱苣苔的不定芽誘導起主要作用，濃度為0.5 mg·L1有利于誘導率和不定芽數量的提高；羅潔等（2016）以培養基MS+TDZ 2.0 μmol·L1+NAA 0.2 μmol·L1為雙片苣苔葉片誘導不定芽發生的適宜培養基。可見，在前人的研究中，6BA結合NAA可以獲得較好的愈傷組織，而TDZ結合NAA可以直接從葉片誘導出不定芽。但潘梅等（2015）發現，采用0.5 mg·L1的TDZ對黃花馬鈴苣苔不定芽的增殖效果并不理想，這與本試驗的研究結果是相一致的。產生這種差異的原因是物種自身基因型的差異，此外，植物生長調節劑種類和濃度也是導致差異產生的重要原因。

通過組織培養獲得再生植株的途徑有兩個：一是直接誘導不定芽途徑，二是通過愈傷組織誘導不定芽途徑。在已有的研究中，桂林小花苣苔（蘇以麗，2012；黃寧珍等，2010a）和半蒴苣苔（阮慧澤等，2014；湯正輝等2005）通過兩種途徑成功建立了其組培快繁體系；菱葉報春苣苔（李翠等，2010）、多齒吊石苣苔（黃寧珍等，2010b）和刺齒唇柱苣苔（湯正輝等，2004）則通過愈傷組織誘導途徑建立了組培快繁體系；而桂黔吊石苣苔（付傳明等，2014）雖然可以誘導出愈傷組織，但愈傷誘導率較低、分化成苗困難。本研究通過兩種途徑成功建立了褐紋報春苣苔的組培快繁體系，但褐紋報春苣苔葉片直接誘導不定芽的組培快繁途徑，比通過愈傷組織誘導不定芽途徑更節省培養時間，而且可以避免因愈傷組織分化不定芽過程可能產生的變異，因此，直接誘導不定芽途徑是褐紋報春苣苔組培快繁的有效途徑。

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