41份葡萄種質遺傳多樣性的ISSR和SCoT對比分析

王發明　李潔維　葉開玉　龔弘娟　莫權輝　蔣橋生　劉平平

摘要： 對收集于廣西桂林的17份野生毛葡萄種質和24份栽培葡萄種質，分別使用12條ISSR和12條SCoT引物進行了遺傳多樣性和親緣關系檢測。結果表明：兩種分子標記均能產生較豐富的多態性片段，可有效應用于葡萄的遺傳多樣性檢測，但在聚類分析結果上表現出一定的差異性，SCoT分子標記能更好地區分野生種質和栽培品種，說明SCoT分子標記在葡萄遺傳多樣性檢測和系統進化研究上可能更有優勢。從SCoT聚類結果上看，廣西植物研究所收集的3個野生毛葡萄種質zws1、zws2和zws3相對其它野生種質而言，更偏向于與栽培種質聚為一類，說明這一類野生毛葡萄可能是這些栽培品種的原始親本來源之一。不同的野生種質聚為多個類群，并表現出明顯的地域特性，但遺傳距離相對較遠，說明桂林野生毛葡萄資源具有豐富的遺傳變異。栽培品種沒有明顯的聚類特點，可能因為所選用的栽培品種的地域代表性并不是很強，也可能是因為栽培品種在不斷的人工雜交選育過程中，遺傳背景趨向一致，遺傳多樣性降低。該研究證明SCoT分子標記在葡萄遺傳多樣性研究上具有一定的優勢。該研究結果為桂林毛葡萄資源的保護、利用和品種選育提供了理論依據，也為葡萄的系統進化研究提供了參考。

關鍵詞： 葡萄， 毛葡萄， 遺傳多樣性， ISSR， SCoT

中圖分類號： Q943

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）01000108

Abstract： Seventeen wild germplasm resources of Vitis heyneana collected from Guilin City of Guangxi Zhuang Autonomous Region and 24 grape cultivars were used to study their genetic diversity and relationship using twelve ISSR and twelve SCoT markers. The results showed that both the two types of molecular markers produced rich polymorphic fragments， and could be used on the genetic diversity study of Vitis. However， the results of cluster analysis showed the difference between ISSR and SCoT， and the SCoT markers rather than ISSR markers were much better at distinguishing the wild and the cultivars of Vitis， therefore， the SCoT markers might have more advantages on the study of genetic diversity and phylogenetic analysis of Vitis. The clustering results of SCoT showed that the three wild V. heynean “zws1”， ”zws2” and “zws3” collected from Guangxi Institute of Botany grouped together with cultivars rather than the other wild ones， which showed that maybe one of the ancestral parents of these cultivars was derived from this category of wild V. heyneana. All the seventeen wild germplasms clustered into different groups and showed distinct regional character， nonetheless， the genetic distance was long between different groups， which showed that the wild V. heyneana had abundant genetic diversity in Guilin. The cultivars did not show obvious clustering characteristics due to the fact that most of them had no regional representativeness or their genetic background were nearly equal due to constantly interbreeding， resulting in low genetic diversity. The findings proved that the SCoT molecular markers had more advantages in the genetic diversity study of Vitis. The findings provides the information for the conservation and utilization and variety breeding of wild V. heyneana in Guilin.

Key words： Vitis， V. heyneana， genetic diversity， ISSR， SCoT

葡萄在世界上具有悠久的栽培歷史，葡萄屬植物在北半球廣泛分布，我國處于葡萄屬植物的東亞分布中心，是重要的原產地之一。全世界葡萄共有70多個種，其中40個種（包括1個亞種）及13個變種起源于中國，種質資源極其豐富（劉崇懷等，2006）。毛葡萄（Vitis heyneana）原產于我國，在我國葡萄屬植物中屬于較原始的種類（劉三軍等，1995）。在廣西，特殊的亞熱帶氣候和喀斯特地貌特征造就了毛葡萄適宜的自然生長環境，特別是在桂中、桂北、桂西等地廣泛分布（彭宏祥等，1999），桂林地處廣西北部，是野生毛葡萄種質資源的重要分布地區之一，具有豐富的遺傳多樣性。野生毛葡萄具有較高的營養和保健價值，其果實富含多種維生素、氨基酸、各種礦物質和微量元素等，具有抗氧化、抗衰老和防癌等功效。在廣西，使用毛葡萄為原料釀造野生葡萄酒具有較悠久的歷史，因其果實含糖量低、單寧含量較高、富含花青素和多種營養元素等，具備良好的釀造加工特性，野生毛葡萄酒因具有獨特的香味和口感而深受消費者喜愛。但野生毛葡萄資源的收集、保護和種質評價等多年來一直沒有受到足夠的重視（鄒瑜，2008）。葡萄屬植物具有豐富的遺傳變異，使得通過常規的形態解剖、生理生化檢測等方法進行分類鑒定非常困難（賀普超等，1999）。因此，從分子生物學角度，通過分子標記等方法研究葡萄種質資源的親緣關系及遺傳多樣性，對于了解葡萄的物種起源和系統進化及遺傳育種、種質資源管理和保護等都具有積極意義。

ISSR （ InterSimple Sequence Repeat ）是由加拿大的Zietkiewcz & Rafalskia （1994）提出的一種分子標記方法，其結合了RAPD和SSR的優點，具有穩定性好、多態性豐富、共顯性、模板用量少、操作簡單等特點，已廣泛應用于植物的品種鑒定、遺傳圖譜構建和基因定位、遺傳多樣性和系統進化分析等研究中。而SCoT標記是首先應用于水稻上的一種基于翻譯起始位點（根據基因ATG翻譯起始位點側翼保守序列設計引物），使用單引物擴增目標基因的功能性分子標記 （Collard & Mackill，2009；熊發前等，2009）。目前，SCoT分子標記方法已在水稻 （Collard & Mackill，2009）、龍眼（陳虎等，2010）、鐵皮石斛（趙瑞強，2012）、桃兒七（Chen et al，2013）、柿（鄧立寶等，2012）、白靈菇（趙夢然等，2012）、麻風樹（Mulpuri et al，2013）、芒果（Luo et al， 2010， 2011）等植物上得到應用。

各種分子標記方法目前在葡萄種質資源遺傳多樣性研究上得到了廣泛應用，但是作為一種較新型的分子標記，SCoT分子標記在葡萄上的應用相對較少（Guo et al，2012），而且其在葡萄遺傳多樣性的研究效果上缺少對比和評價。本研究通過比較ISSR分子標記與SCoT分子標記在野生和栽培葡萄品種的遺傳多樣性研究上的應用，對SCoT分子標記的應用效果進行評價，同時通過研究野生毛葡萄與栽培葡萄的遺傳多樣性和親緣關系，為廣西毛葡萄資源的保護、利用和品種選育提供參考，也為葡萄的系統進化研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1 材料

17份桂林毛葡萄資源分別收集于資源縣（修睦、莆田、大源、中峰、官洞村等地）、興安縣（茨林口、華江、黃毛灘等地）、臨桂區（安江坪等地）、雁山區（廣西植物研究所）等地，24份葡萄品種資源采集于廣西植物研究所鮮食葡萄種質資源圃[包括京亞（Jingya）、香玉（Xiangyu）、藤稔（Fujiminori）、黑加侖（Ribes nigrum）、克倫森（Crimson）、紅雙味（Hongshuangwei）、維多利亞（Victoria）、玫瑰香（Muscat）、夏黑（Summer Black）、紅玫瑰（Red Rose）、紅地球（Red Globe）、紅乳（Hongru）、比昂扣（Rosario Bianco）、美夏40（Meixia 40）、巨峰（Kyoho）、美滿（Meiman）、無核白（Thomson Seedless）、圣誕玫瑰（Christmas Rose）、美譽（Meiyu）和zws雜（zwshybrid）等20個品種]和桂林市農科所（包括NKS2、NKS4、NKS5、NKS6等4個雜交品種）。取樣材料為幼嫩葉片，硅膠干燥后提取基因組DNA。使用的dNTPs、DNA聚合酶和DNA ladder等試劑購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 DNA提取與檢測

參照Ergül et al（2006）的方法，使用改良CTAB法提取葡萄栽培品種和野生毛葡萄的全基因組DNA，使用紫外分光光度法和瓊脂糖電泳法檢測其DNA質量，將DNA稀釋到合適濃度用于PCR擴增。剩余DNA保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 引物篩選

使用的ISSR引物根據加拿大哥倫比亞大學UBC公司公布的100 條引物序列（http：//www.biotech.ubc.ca/services/naps/primers.html.）進行合成，SCoT引物根據Collard & Mackill （2009）公布的36條引物序列和Luo et al（2011）公布的40條引物序列進行合成。在BioRad S1000 PCR儀上對所有引物進行篩選，最終篩選出擴增產物條帶清晰、多態性好的12條ISSR引物（表1）和12條SCoT引物（表2），用于所有DNA樣品擴增。

1.4 PCR反應與檢測

ISSR和SCoT的反應體系和擴增程序基本一致。20 μL反應體系包括2×Taq PCR Mix 10 μL，DNA（50 ng·μL1） 1.0 μL，10 μmol·L1引物0.8 μL，超純水8.2 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 S，復性40 S（退火溫度隨引物而定），72 ℃延伸1 min，循環34次；72 ℃延伸10 min。取8 μL擴增產物，使用2%的瓊脂糖（預加EB）電泳分離，電壓為5 V·cm1，電泳緩沖液為1×TAE，電泳結束后在紫外分析儀上觀察并拍照保存。

1.5 數據分析

對所有的ISSR和SCoT分子標記圖譜進行分析，先根據相同遷移率下同一位點DNA 擴增條帶的有無分別記為1和0，再合并1/0矩陣后使用NTSYSpc2.10e軟件和UPGMA方法對41份樣品進行聚類分析。

2結果與分析

2.1 ISSR與SCoT的多態性分析

12條ISSR引物在41份葡萄樣本中共擴增出121個DNA位點，其中多態性位點107個，多態率占88.4%；單條引物擴增的條帶數為7～11條，平均約10條。12條SCoT引物共擴增出130個DNA位點，其中多態位點116個，多態率占89.2%；單條引物擴增條帶數為8～14條，平均為11條。兩種引物擴增的片段范圍大多集中250～2 000 bp之間，二者擴增的DNA位點數和多態性位點比率相差無幾，單條引物擴增能力也基本一致。部分引物的擴增結果見圖1和圖2。

2.2 ISSR和SCoT聚類分析

根據兩種分子標記的擴增結果，使用UPGMA

方法對41份材料分別進行聚類分析。由ISSR聚類分析的結果（圖3）可見，在遺傳相似系數0.84處，京亞、香玉、藤稔、美滿、黑加侖、維多利亞、紅雙味、NKS4、巨峰、紅地球、NKS2等11個品種聚為一類，克倫森、夏黑、紅玫瑰、紅乳、比昂扣、zws雜等6個品種聚為一類，而其它栽培品種及野生種質大多沒有明顯的聚類關系。而使用SCoT方法（圖4），在遺傳相似系數0.77處將41份供試材料分為6個類群，其中第Ⅰ類群包含全部的栽培種質和廣西植物研究所內收集的3個野生種質zws1、zws2和zws3，第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ類均只包含野生種質，并且野生種質之間的聚類趨勢表現出較明顯的地域特性。兩種分子標記的聚類結果均顯示廣西植物研究所內收集的3個野生種質zws1，zws2，zws3明顯聚為一類，且與栽培品種的遺傳距離相對較近；而安江坪2號與所有葡萄種質的遺傳距離最遠。總體看來，兩種分子標記的聚類結果有一定差距，但SCoT方法能更好地區分栽培品種和野生種質。

3討論

3.1 ISSR和SCoT分子標記的應用效果比較

目前，ISSR分子標記在葡萄的遺傳多樣性和系統進化研究等方面得到了廣泛應用（吳子龍等，2006；張永輝等，2011；賴呈純等，2014），但是SCoT分子標記在葡萄遺傳多樣性上的研究相對較少。在引物設計上，二者對于不同植物均具有普適性和通用性，可以大大提高引物的利用率，節約成本；二者均使用單一引物進行擴增，操作起來更方便；二者均可以使用較高的退火溫度進行擴增，提高了擴增結果的特異性和穩定性。本研究結果證明ISSR和SCoT分子標記都可以產生豐富的遺傳多態性位點，無論在單條引物的擴增條帶數和多態性條帶比率上都相差不大，說明二者都可以有效地應用于葡萄種質遺傳多樣性研究上。但二者的聚類分析結果具有一定的差異性，41份葡萄種質的聚類分析結果顯示，SCoT標記能更好地區分栽培品種與野生種質。前人在其它物種上的研究也表明SCoT分子標記相對于ISSR分子標記在植物遺傳多樣性研究上更有效和更穩定（趙丹等，2014），這可能與其引物的設計方法有關，SCoT分子標記是依據植物基因中的ATG 翻譯起始位點側翼序列的保守性，設計單引物并對基因組進行擴增，所以可能使其更多的擴增位點位于基因組的編碼區，從而使標記的聚類結果與表型之間更具相關性。本研究證明SCoT分子標記在葡萄種質資源遺傳多樣性評價和系統進化研究上可能更具優勢。

3.2 葡萄種質資源的遺傳多樣性及其親緣關系

以SCoT分子標記的聚類分析結果為例，在遺傳相似系數0.77處可以將全部的栽培品種聚為一類，而這些品種包括了歐亞種、歐美雜種、美國雜種、日本雜種及國內雜交培育等較多來源，但是這些品種之間沒有明顯的聚類關系，可能因為本次選用的栽培品種的地域代表性不是很強，也說明栽培品種在不斷的人工定向雜交選育過程中，遺傳背景趨向一致，遺傳多樣性降低。收集于廣西植物所內的3份野生種質zws1，zws2和zws3相對其它野生種質而言與栽培品種的遺傳距離更近，說明這一類野生毛葡萄可能是這些栽培品種的原始親本來源之一。其余類群均為野生種類，并且這些野生種質的遺傳距離相對較遠，說明了廣西野生毛葡萄資源具有豐富的遺傳變異。特別是安江坪2號種質，與其它野生種質的遺傳距離最遠，這也與其較為特殊的表型對應，雖然將其判定為毛葡萄種質，但是相對于其它毛葡萄種類具有許多的特殊表型，因此有必要將其作為一種特殊的種質進行進一步研究。另外可以看出，雖然同一采樣地點的野生毛葡萄種質大多聚為一類，表現出明顯的地域特性，但總體仍表現出豐富的遺傳多樣性。

葡萄栽培品種在優異園藝性狀的人為定向篩選過程中，不可避免地丟失部分“低劣”的性狀位點及其與之連鎖的其它基因位點，而這些位點很有可能包含了人們所未知的一些重要功能基因，特別是抗病、抗逆性基因，所以廣泛使用少數優良品種的繼代栽培及以其為父、母本進行雜交培育新品種的行為可能導致其品種的退化和加劇其遺傳多態性的降低。而野生種類在漫長的自然選擇過程中，具備了較強大的適應能力和抗病蟲、抗逆特性，并且可能保留一些有益的突變位點，為葡萄品種的培育提供了重要的基因資源。因此對葡萄野生資源進行收集、保存和鑒定，并對其優異性狀進行利用，是葡萄優良品種培育的重要基礎和保障，具有重要的應用價值和現實意義。

參考文獻：

CHEN DX，ZHAO JF，LIU X，et al，2013. Genetic diversity and genetic structure of endangered wild Sinopodophyllum emodi by start codon targeted polymorphism [J]. Chin J Chin Mat Med，38（2）：278-283.

CHEN H，HE XH，LUO C，et al，2010. Analysis on the genetic diversity of 24 Longan（Dimocarpus longan）Accessions by SCoT markers [J]. Acta Hortic Sin，37（10）：1651-1654. [陳虎，何新華，羅聰，等，2010. 龍眼24 個品種的SCoT 遺傳多樣性分析 [J]. 園藝學報，37（10）：1651-1654.]

COLLARD CY，MACKILL DJ，2009. Start codon targeted（SCoT） polymorphism： a simple，novel DNA marker technique for generating genetargeted markers in plants [J]. Plant Mol Biol Rep，27（1）：86-93.

DENG LB，HE XH，LI TW，et al，2012. Investigation and analysis on the genetic diversity of persimmon germplasms in plateau of northwest Guangxi [J]. Acta Hortic Sin，39（2） ：215-224. [鄧立寶，何新華，李天文，等， 2012. 廣西西北部高原地區柿種質資源調查及遺傳多樣性分析 [J]. 園藝學報，39（2）：215-224.]

ERGL A，KAZAN K，ARAS S，et al， 2006. AFLP analysis of genetic variation within the two economically important Anatolian grapevine （Vitis

vinifera L. ） varietal groups [J]. Genome，49（5） ：467-475

GUO DL，ZHANG JY，LIU CH，2012. Genetic diversity in some grape varieties revealed by SCoT analyses [J]. Mol Biol Rep，39（5）：5307-5313.

HE PC，1999. Wild grape resources and utilization in China [J]. Sinoovers Grapev & Wine，（10）：12-13. [賀普超，1999. 中國野生葡萄資源與利用 [J]. 中外葡萄與葡萄釀酒：50 年特，（10）：12-13.]

LAI CC，FAN LH，HANG XG，et al， 2014. Assessment of genetic relationships among grapes （Vitis） varieties using ISSR markers [J]. J Fujian Agric For Univ（Nat Sci Ed），43（1）：20-28. [賴呈純，范麗華，黃賢貴，等，2014. 葡萄品種資源遺傳關系的ISSR分析 [J]. 福建農林大學學報（自然科學版），43（1）：20-28.]

LIU CH，SHEN YJ，CHEN J，et al， 2006. Outlining “the description and data standard for grape （Vitis）” and discussion on its use [M]. Beijing：China Agriculture Press. [劉崇懷，沈育杰，陳俊，等，2006. 葡萄種質資源描述規范和數據標準 [M]. 北京：中國農業出版社.]

LIU SJ，KONG QS，1995. Studies on the taxonomy of wild grape species native to China [J]. J Fruit Sci，12（4）：224-227. [劉三軍，孔慶山，1995. 我國野生葡萄分類研究 [J]. 果樹學報，12（4）：224-227.]

LUO C，HE XH，CHEN H，et al， 2011. Genetic diversity of mango cultivars estimated using SCoT and ISSR markers [J]. Biochem Syst Ecol，39：676-684.

LUO C，HE XH，CHEN H，et al， 2010. Analysis of diversity and relationships among mango cultivars using Start Codon Targeted（SCoT） markers [J]. Biochem Syst Ecol，38：1176-1184.

MULPURI S，MUDDANURUA T，FRANCIS G，2013. Start codon targeted（SCoT） polymorphism in toxic and nontoxic accessions of Jatropha curcas L. and development of a codominant SCAR marker [J]. Plant Sci，207：117-127.

PENG HX，LIU RG，ZOU Y，et al，1999. Investigation on wild grape resources and propagation technology in limestone mountain areas of west Guangxi [J]. SW Chin J Agric Sci，12（4）：101-105. [彭宏祥，劉榮光，鄒瑜，等，1999. 桂西巖溶山區野生葡萄資源與繁殖技術 [J]. 西南農業學報，12（4）：101-105.]

WU ZL，FANG LY，WANG J，et al， 2006. Analysis of genetic relationship of 15 Vitis germplasm resources by ISSR markers [J]. J Fruit Sci，23（4）：605-608. [吳子龍，方連玉，王軍，等， 2006. 15份葡萄種質親緣關系的ISSR分析 [J]. 果樹學報，23（4）：605-608.]

XIONG FQ，TANG RH，CHEN ZL，et al， 2009. SCoT：a novel gene targeted marker technique based on the translation start codon （SCoT） [J]. Mol Plant Breed，7（3） ：635-638. [熊發前，唐榮華，陳忠良，等. 2009. 目標起始密碼子多態性（SCoT）：一種基于翻譯起始位點的目的基因標記新技術） [J]. 分子植物育種，7（3）：635-638.]

ZHANG YH，LIU CH，FAN XC，et al， 2011. Application of ISSR markers in taxonomy of Chinese wild grape [J]. J Fruit Sci，28（3）：406-412. [張永輝，劉崇懷，樊秀彩，等，2011. ISSR 標記在中國野生葡萄分類中的應用 [J]. 果樹學報，28（ 3）：406-412.]

ZHAO D，DING L，ZHOU T，et al， 2014. Genetic diversity analysis of Lonicera macranthoides cultivars in Guizhou by ISSR and SCoT markers [J]. Guizhou Agric Sci，42（1）：21-25. [趙丹，丁鈴，周濤，等，2014. 貴州栽培灰氈毛忍冬的遺傳多樣性ISSR與SCoT標記 [J]. 貴州農業科學，42（1）：21-25.]

ZHAO MR，CHEN Q，HUANG CY，et al， 2012. SCoT Analysis of genetic polymorphism for wild germplasm of Pleurotus eryngii var. tuoliensis from China [J]. Acta Hortic Sin，39（12）：2475-2482. [趙夢然，陳強，黃晨陽，等，2012. 中國野生白靈菇遺傳多樣性的SCoT分析 [J]. 園藝學報，39（12）：2475-2482.]

ZHAO RQ，2012. Study of genetic diversity based on molecular marker in germplasms resources of Dendrobium officinale [D]. Linan： Zhejiang A & F University. [趙瑞強，2012. 基于分子標記的鐵皮石斛種質資源遺傳多樣性研究 [D]. 臨安：浙江農林大學.]

ZIETKIEWICZ E，RAFALSKIA L，1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR） anchored polymerase chain reaction amplification [J]. Genomics，20：176-183.

ZOU Y，2008. Research advance in germplasm resource and utilization of V. heyneana [J]. J Guangxi Agric Sci，39（5）：664-667. [鄒瑜，2008. 野生毛葡萄種質資源利用及其研究進展 [J]. 廣西農業科學，39（5）：664-667.]