轉植酸酶玉米安全性評價研究進展

譚燕華 謝翔 夏啟玉 張麗麗 霍姍姍 張家明 郭安平

摘 要 玉米種子含有豐富的磷，但大部分磷以植酸磷的形式存在，難以被豬和禽類等單胃動物利用。轉植酸酶基因玉米是中國唯一獲得安全證書的轉基因玉米，含有高濃度的植酸酶，能夠提高動物對植酸磷的利用率；減少排泄物對環境的污染，具有商業化種植前景。轉基因作物需要進行必要的安全評價。本文綜述了近年來轉植酸酶基因玉米安全性評價研究，主要包括轉植酸酶基因和目標蛋白的檢測、食用安全性評價、環境安全評價及非預期影響的研究，并對轉植酸酶基因玉米應用及安全評價體系的發展作了展望。

關鍵詞 轉基因玉米；安全評價；植酸酶

中圖分類號 S514 文獻標識碼 A

Abstract Maize is one of the most important feed crops in China and it is rich in phosphorus. However， most phosphorus is trapped in phytate phosphorus and which is difficult to be used by animals such as pigs and poultry. Phytase transgenic maize contains high concentration of phytase and can increase the phosphate uptake of animals， which is the only transgenic maize that has been officially issued with a biosafety certificate in China and has great potential in the animal feed industry. Genetically modified crops should carry out safety evaluation before commercial application. In this article， we mainly reviewed the safety evaluation of phytase transgenic maize in recent years， including phytase gene and protein detection， food safety evaluation， environmental safety evaluation， and unintended effects. The application of phytase transgenic maize and the development of safety evaluation system were also discussed.

Key words Transgenic maize； safety evaluation； phytase

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.032

玉米是我國重要的糧食和飼料用作物，生產中每年大約80%的玉米用于飼料行業。磷是動物生長發育不可缺少的元素之一，玉米中含有豐富的磷，但大部分的磷是以植酸磷的形式存在，這種形式存在的磷難以被豬和禽類等單胃動物利用。因此，能夠增加動物磷酸鹽攝取的轉植酸酶基因玉米，對養殖業顯得非常重要和有必要。植酸酶（phytase）是催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸鹽的酶的總稱，是一種可使植酸磷復合物中的磷變成可利用磷的酸性磷酸酯酶。陳茹梅等用玉米胚特異性球蛋白-1啟動子在玉米種子中過表達黑曲霉（Aspergillus niger）菌株的植酸酶基因，得到了含有高濃度植酸酶的轉基因玉米，其植酸酶活性達到約2 200 U/kg種子，比非轉基因玉米種子約增加了50倍[1]，完全能滿足生產應用需要，可以替代傳統方式中用微生物發酵生產的植酸酶[2]。目前，轉植酸酶基因玉米是我國唯一獲得安全證書的轉基因玉米，但還未進行商業化種植。轉基因作物商業化種植前必須進行必要的安全評價。近年來，已對轉植酸酶基因玉米安全性評價進行了許多研究。

1 植酸酶基因玉米轉化事件和目標蛋白的檢測

隨著轉植酸酶基因作物的開發和對轉基因作物的監管要求，需要準確地對產品進行驗證[3]。為了對轉基因作物目標基因進行檢測，已對轉植酸酶基因玉米進行了定性、定量PCR檢測技術方法的研究[4-5]，農業部已于2012年頒布了植酸酶基因玉米定性PCR檢測技術標準（農業部 1782 號公告-11-2012），詳細的方法見表1。李俊等以真菌來源的植酸酶基因為研究對象，建立了植酸酶基因的特異性檢測方法，可檢測各種含有該基因的轉基因作物；同時還構建了陽性質粒分子pBS Endogenous-phytase，可作為轉植酸酶基因作物的檢測陽性材料[6]（圖1）。

酵母中表達和純化的phyA2蛋白被糖基化，其分子量約為75 ku；去糖基化蛋白的分子量從氨基酸序列預測約為55 ku；植酸酶蛋白在轉基因玉米種子樣品中顯示的帶約60 ku[1]。對目標蛋白植酸酶蛋白的檢測進行了ELISA、Western blot、免疫親和層析等多種方法的研究[7-8]。閆廣為等用60%～80%硫酸銨分級沉淀植酸酶，得到的植酸酶比活要比粗提液高6.1倍[8]。種子中提取的轉植酸酶基因蛋白帶在SDS-PAGE不分離[1]，趙倩倩等用80%硫酸銨沉淀植酸酶蛋白粗提液，透析后再通過免疫親和層析得到了在 SDS-PAGE膠上單一條帶的植酸酶蛋白[7]。Zhou等開發了一種快速免疫層析側流裝置，運用4種單克隆抗體（EH10a，FA7，AF9a，和CC1），能夠快速檢測出轉基因玉米中重組尼日爾曲霉phyA2表達蛋白[9]（圖2）。

2 轉植酸酶基因玉米食用安全性評價

對轉基因植酸酶玉米進行食用安全性評價時，首先比較了轉基因植酸酶玉米與非轉基因對照玉米營養成分的差異。轉基因玉米與非轉基因對照玉米相比，在主要成分（蛋白質、脂肪、氨基酸、淀粉、水分、灰分等）、微量營養成分（礦物質、維生素）等方面，沒有生物學意義上的差異，具有實質等同性。但轉基因玉米中植酸酶活性明顯高于非轉基因玉米，非植酸磷含量比非轉基因玉米高1倍[10]。Gao等報道，轉基因植酸酶玉米與常規玉米相比，植酸酶活性有顯著差異（p<0.001），但化學成分差異不顯著。其中粗蛋白、總能量、總脂肪、灰分和礦物質含量差異不顯著（p>0.05）；氨基酸分析顯示2種玉米的氨基酸含量也相似（p>0.05）。不過2種玉米在濕度上有顯著性差異（p<0.001）[11]。

食用安全性分析顯示，轉植酸酶基因玉米作為飼料喂養肉仔雞，對其生長性能[12]、血清生理生化指標、免疫器官發育及免疫功能[13]均無不良影響，未出現“非期望效應”；對蛋雞的產蛋性能和雞蛋品質均無影響[14-16]。對長期（50周）喂養植酸酶轉基因玉米的蛋雞檢測了食糜、血液、組織、和雞蛋中的轉基因和內源植物DNA片段和蛋白質，分析發現phyA2基因和蛋白在消化道很快降解，沒有在血液、組織和雞蛋中檢測到phyA2基因和蛋白[15]。喂食轉基因玉米比喂食非轉基因玉米的豬含有著更容易消化和代謝的能量以及更高的的消化率[17]。飼糧中使用轉植酸酶基因玉米有利于提高生長豬的生長性能[14]。因此飼喂轉植酸酶基因玉米與常規玉米是同等安全的，且轉植酸酶基因玉米可提高單胃動物對日糧中磷的利用率，從而減少日糧中無機磷的添加量，節約磷資源，降低磷的排出對環境造成的污染。

3 轉植酸酶基因玉米環境安全性評價

對轉基因植酸酶玉米環境安全性評價的研究也是研究的熱點。目前對轉植酸酶玉米進行環境安全性評價的研究主要是花粉介導的外源基因漂移以及對生物多樣性的影響；對生物多樣性的影響包括對節肢動物生物多樣性的影響以及對土壤微生物多樣性的影響。

轉基因玉米花粉擴散的頻率和距離受環境影響，在不同日期、不同氣象條件下，花粉漂移擴散的距離不盡相同。趙宗潮等采用花粉染色法研究了轉植酸酶基因玉米花粉的擴散頻率和距離，結果表明，花粉擴散的風險概率在不同方位有不同，擴散的頻率隨著距離增加而降低；在試驗期間花粉擴散的最遠距離可達35 m[18]。

對田間節肢動物種群動態及多樣性的影響研究表明，轉植酸酶基因玉米的種植未對田間主要害蟲和天敵種群動態產生顯著影響[19-20]；對亞洲玉米螟和棉鈴蟲的生長和營養利用均無影響[21]；對步甲物種多樣性及常見物種沒有明顯影響[22]。

對土壤生物的群落結構和多樣性研究表明轉植酸酶玉米的田間種植未對土壤線蟲的生態指標和群落結構造成直接影響[23]。同一時期同一種微生物數量在種植轉植酸酶玉米、非轉基因玉米及空白土壤中基本相同[24]；對土壤酶活性的影響中土壤蔗糖酶、土壤蛋白酶及土壤脲酶活性均無顯著影響；而對土壤酸性磷酸酶活性有顯著影響，轉植酸酶玉米的土壤酸性磷酸酶活性顯著高于親本非轉植酸酶玉米的土壤，這說明轉植酸酶玉米顯著提高了土壤酸性磷酸酶的活性，進而對土壤中磷酸酯的水解會起到一定的促進作用[25]。

4 非預期影響的評價

轉基因作物由于導入外源基因而使植物基因組發生改變，可能會導致意想不到的影響，從而影響人類的健康或環境[26]，隨著轉基因作物的商業化，這些非預期的未知影響是轉基因作物生物安全研究的熱點之一。評價非預期影響中，高通量的“組學”技術比有目標分析評價具有優勢[27-28]，包括轉錄組學、代謝組學、蛋白質組學等。其中蛋白質直接參與代謝和細胞的生長，多數外源基因的表達或調控產物是蛋白質[29]，一些毒素、抗營養因子或過敏原等蛋白還可能對人體健康產生很大的影響。因此，從蛋白質組學上對轉基因作物生物安全性進行非預期影響評價非常重要[30]。

在轉基因玉米的非預期影響研究中，由于抗蟲轉基因玉米MON810在商業上的重要性，其與對照的非預期影響已被廣泛的研究，分別從轉錄組學[31-34]、代謝組學[35-38]、蛋白質組學上[39-42]進行了比較研究，結果表明轉基因玉米MON810在轉錄組水平、代謝水平、蛋白質水平上與其對照常規玉米具有實質等同性。

我們對轉植酸酶玉米進行了比較蛋白質組學研究，獲得了轉植酸酶玉米葉片和種子的總蛋白2DE圖譜，其中葉片鑒定了44個差異蛋白，COG功能分類表明這些差異蛋白主要與碳水化合物的轉運與代謝相關，其次與翻譯后修飾相關；KEGG分析顯示差異蛋白主要是參與光合作用的碳固定途徑[43]。利用2DE-MS/MS和iTRAQ技術一共鑒定了148個差異蛋白，COG功能分類表明差異蛋白主要是參與轉錄后調控與轉錄后修飾的蛋白[44]。與傳統育種的作物相比，轉植酸酶玉米葉片與常規玉米葉片具有實質等同性，轉基因沒有顯著改變玉米的蛋白質組。

5 展望

轉植酸酶基因玉米作為飼料用玉米在我國的推廣使用有著極為重要的意義。目前對轉植酸酶基因玉米進行的安全性評價主要是食用安全性方面的評價以及環境安全性評價，且主要是針對特定目標進行可預期影響的評價，結果顯示轉植酸酶玉米與非轉基因對照玉米一樣是安全的。但對轉植酸酶基因玉米從組學上進行的非預期影響的研究還很少，我們從蛋白質組學上進行了比較分析，還未見從轉錄組學、代謝組學層面上進行比較研究。因此還應加強對轉植酸酶基因玉米非預期影響的研究。

轉基因作物的安全性評價是一項長期工作，需要建立科學的評價技術體系進行長期跟蹤監測。首先，轉基因作物的安全性評價應遵循個案的原則一個一個的進行。其次，對轉基因作物進行安全性評價時，既要用目標分析法對其進行預期影響進行評價，還應使用非目標的組學方法對其進行非預期影響研究。其中對轉基因作物的生態風險及環境安全進行評價研究時，在不同地區、不同土壤類型條件下，需要分別進行長期定位監測。評價轉基因作物的非預期影響時，還應結合多種組學技術，包括轉錄組學、代謝組學和蛋白質組學技術等，評價可以更全面、更客觀[41]。

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