抗腫瘤環九肽crourorb A1的固相合成

吳 也，王許夢，林 樂，凌保東,2，廖洪利,2*

(1.成都醫學院藥學院，四川 成都 610083；2.四川省高校結構特異性小分子藥物重點實驗室，四川 成都 610500)

抗腫瘤環九肽crourorb A1的固相合成

吳 也1，王許夢1，林 樂1，凌保東1,2，廖洪利1,2*

(1.成都醫學院藥學院，四川 成都 610083；2.四川省高校結構特異性小分子藥物重點實驗室，四川 成都 610500)

通過Fmoc固相合成法，以Rink Amide MBHA 樹脂為載體、Fmoc-Asp-OAll為起始原料、DIEA/HCTU為縮合體系，按照crourorb A1的氨基酸序列由C端向N端依次偶聯后，在樹脂上實現環合，切割后經制備型RP-HPLC純化，得到純度為98%的抗腫瘤環九肽crourorb A1，總收率34%。

crourorb A1；抗腫瘤；固相合成；環肽

大戟科巴豆屬，分布于熱帶和亞熱帶地區，包含1 300多種草藥、灌木和喬木[1-2]。其中，巴豆屬海厄戟木(Croton urucuranaBaillon)被廣泛種植于巴西中西部，當地人稱之為“龍血樹”[3]，該樹流有紅色乳液，有止痛、消炎[4]、抗潰瘍[5]、抗菌[6]和抗腫瘤[7-8]等藥理活性，具有重要的民族藥理學意義。但對于乳液的有效成分卻鮮有研究，直到Cndidobacani等[9]從乳液中分離得到一種新型環九肽crourorbA1，其具有阿霉素相當的細胞毒性，這使得該環肽有望成為新的抗腫瘤藥物。

crourorbA1由9個氨基酸殘基構成，結構為：Cyclic[Asn-Gly-Phe-Ala-Gly-Leu-Ser-Gly-Leu](圖 1),相對分子質量為816.90 Da。國內外關于crourorb A1的全合成未見文獻報道。作者首次采用Fmoc固相合成法，通過天冬氨酸的正交保護在樹脂上實現環合，切割后獲得目標產物。

圖 1 crourorb A1的結構式

1 實驗

1.1 試劑與儀器

Fmoc-氨基酸、Rink Amide MBHA樹脂、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)，上海吉爾生化有限公司；N,N-二異丙基乙胺(DIEA)、3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(HOAt)、(7-氮雜苯并三唑-1-氧)三吡咯磷六氟磷酸鹽(PyAOP)、N-甲基嗎啉(NMM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、三氟乙酸(TFA)、苯硅烷、四(三苯基膦)鈀(0)(Pd[P(Ph)3]4)，北京百靈威科技有限公司；茚三酮、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、哌啶均為市售分析純試劑；乙腈為色譜純。

氣浴恒溫振蕩器，常州國宇儀器制造有限公司；SHB-ⅢA型循環水式多用真空泵、2ZX-4型旋片真空泵，上海豫康科教儀器設備有限公司；低溫冷卻循環泵，上海東璽制冷儀器設備有限公司；LD5-2A型低速離心機，北京京立離心機有限公司；LC-6A型制備液相色譜儀、Prominence LC-20AD型高效液相色譜儀，島津公司；6538 UHD Accurate Mass Q-TOF LC/MS質譜儀，安捷倫公司。

1.2 方法

crourorb A1的固相合成路線見圖2。

圖 2 crourorb A1的固相合成路線

1.2.1 crourorb A1的直鏈合成

取Rink Amide MBHA樹脂500 mg(載樣量為0.27 mmol·g-1)加入到固相合成反應管中，用DCM浸泡20 min使樹脂充分溶脹，抽干待用。加入20%哌啶/DMF溶液10 mL，振蕩10 min × 2脫去樹脂上的Fmoc，依次用DCM、DMF洗滌樹脂各3次。隨后將Fmoc-Asp-OAll(395 mg，1 mmol)、HCTU(372 mg，0.9 mmol)和DIEA(350μL，2 mmol)混溶于7 mL DMF，加入到樹脂中，振蕩1 h，抽濾后依次用DCM、DMF洗滌樹脂各3次，加入5 mL醋酸酐/吡啶混合溶液封閉20 min，乙酰化所有未反應的樹脂。之后根據多肽序列加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH，重復脫保護→縮合→脫保護，直到所有氨基酸連接完成。縮合過程中通過茚三酮顯色監測反應進程。

1.2.2 樹脂上環合

直鏈完成后，將Pd[P(Ph)3]4(2 eq)、苯硅烷(5 eq)溶于7 mL DCM，加入到樹脂中，避光振蕩3 h，脫去Asp上的烯丙基[10]。抽濾后依次用DCM、DMF洗滌樹脂各5次，脫Fmoc保護，加入HOAt(5 eq)、PyAOP(5 eq)、NMM(10 eq)和7 mL NMP，振蕩環合，24 h后抽濾重復一次。

1.2.3 切割與脫保護

將樹脂洗凈抽干，加入TFA∶DCM =9∶1(體積比)混合溶劑15 mL，振蕩2 h，過濾，用少許TFA洗滌樹脂，加入30 mL冰乙醚，0 ℃靜置過夜，3 000 r·min-1離心3 min，棄上清液，重復2次，自然風干即得crourorb A1粗品。

1.2.4 crourorb A1的分離純化

將粗肽用甲醇溶解，通過制備型RP-HPLC純化。色譜條件：制備柱Grace Vydac Peptide C18柱(250 mm× 10 mm，10μm)；檢測波長214 nm；流動相A為0.1% TFA乙腈溶液，流動相B為0.1% TFA水溶液，梯度洗脫(0～40 min，流動相B：90%～0%)；流速4.0 mL·min-1。收集主峰，冷凍干燥后得到純品37 mg，

為白色粉末，總收率34%。

1.2.5 crourorb A1的分析與表征

對crourorb A1純品進行HPLC分析。測試條件：分析柱Grace Vydac Protein & Peptide C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；檢測波長214 nm；流動相A為0.1% TFA乙腈溶液，流動相B為0.1% TFA水溶液，梯度洗脫(0～35 min，流動相B：90%～0%)；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃。

對crourorb A1純品進行HR-Q-TOF-MS測試。

2 結果與討論

2.1 HPLC分析(圖 3)

圖 3 crourorb A1純品的HPLC圖譜

由圖3可知，crourorb A1純品保留時間為15.274 min，經計算其純度為98%。

2.2 質譜分析(圖 4)

圖4 crourorb A1純品的HR-Q-TOF-MS圖譜

由圖4可知，分子離子峰[M+H]+= 817.4204，[M+Na]+=839.4017，crourorb A1分子量與理論值816.90相符。

3 結論

采用Fmoc固相合成法，以Rink Amide MBHA 樹脂為載體、Fmoc-Asp-OAll為起始原料、DIEA/HCTU為縮合體系，按照crourorb A1的氨基酸序列由C端向N端依次偶聯后，在樹脂上實現環合，切割后經制備型RP-HPLC純化，得到純度為98%的抗腫瘤環九肽crourorb A1，總收率34%。相比液相環合，固相合成操作更簡單適用，避免了環合時肽與肽之間的縮合以及后處理的諸多麻煩。本合成方法為crourorb A1進一步的藥理學、藥效學研究提供原料，并為含有天冬酰胺的環肽藥物規模化生產提供參考。

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Solid-Phase Synthesis of Crourorb A1 of Anti-Tumor Cyclic Nanopeptide

WU Ye1，WANG XU-meng1，LIN Le1，LING Bao-dong1,2，LIAO Hong-li1,2*

(1.SchoolofPharmacy，ChengduMedicalCollege，Chengdu610083，China；2.KeyLaboratoryNamedSpecialStructureSmallMoleculeDrugsinUniversityofSichuanProvince，Chengdu610500，China)

UsingFmocsolid-phasepolypeptidesynthesis(SPPS)withRinkAmideMBHAresinasasolidsupport，Fmoc-Asp-OAllasastartingmaterial，andDIEA/HCTUasacondensationsystem，crourorbA1wassynthesizedaccordingtoitsamineacidsequenceformC-terminaltoN-terminalbysequentialcouplingandcyclizationontheresin.Aftercleavage，theanti-tumorcyclicnanopeptidewaspurifiedbypreparativeRP-HPLCwithafinalpurityof98%andyieldof34%.

crourorbA1；anti-tumor；solid-phasesynthesis；cyclicpeptide

四川省高校科研創新團隊項目(13TD0028),國家大學生創新創業訓練計劃項目(201513705024)

2016-10-24

吳也(1990-)，男，四川達州人，碩士研究生，研究方向：抗腫瘤藥物合成，E-mail：jjcwf@126.com；

廖洪利，副教授，E-mail：liaohl213@126.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.03.008

R979.1 R914.5

A

1672-5425(2017)03-0031-04

吳也，王許夢，林樂,等.抗腫瘤環九肽crourorb A1的固相合成[J].化學與生物工程，2017，34(3)：31-34.