檸檬酸酯化對原淀粉和預糊化淀粉性能的影響

周中凱，楊蕊，申曉鈺

（天津科技大學，天津300457）

檸檬酸酯化對原淀粉和預糊化淀粉性能的影響

周中凱，楊蕊，申曉鈺

（天津科技大學，天津300457）

以高直鏈玉米淀粉為原料，通過濕熱處理制備預糊化淀粉，然后分別進行檸檬酸酯化處理。利用體外消化模型、傅立葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）、掃描電鏡（Scanning electron microscopy，SEM）和熱重分析（Thermogravimetricdifferentialthermalanalyzer，TG）等方法研究兩種高直鏈淀粉性質的差異。結果表明，與原淀粉相比，預糊化處理更顯著提高淀粉的酯化程度并相應地降低其消化率。兩種酯化淀粉性質比較發現，預糊化淀粉的檸檬酸酯化會導致比原淀粉的檸檬酸酯化樣品更低的消化率，這種低消化率的發生與其高取代度有關，其關聯性通過傅立葉變換紅外光譜的特征吸收驗證。同時，TG分析表明，檸檬酸酯化的預糊化淀粉其熱分解溫度更高，熱穩定性更強。這些結構特征均可能與其低消化率有關。本研究的深入對于進一步提高淀粉中的抗性淀粉含量具有一定的指導意義。

高直鏈玉米淀粉；抗性淀粉；檸檬酸酯化；抗消化性

膳食纖維是指不能被人體消化道酵素分解的多糖類及木植素[1]。在消化系統中有吸收水分的作用；能促進腸胃蠕動，可舒解便秘；同時也能吸附腸道中的有害物質以便排出，改善腸道菌群，為益生菌的增殖提供能量和營養[2]?？剐缘矸劬褪瞧渲械囊环N[3]。1992年，世界糧農組織（The world's food and agriculture organization，FAO）根據Englyst和歐洲抗性淀粉研究協作網（EURESTA）的建議，將抗性淀粉定義為：健康者小腸中不易吸收的淀粉及其降解產物[4]。近年的研究已經初步證明，抗性淀粉具有治療便秘，控制糖尿病，促進脂類、膽固醇代謝，促進礦物質吸收，增強疾病抵抗力等與膳食纖維相似的生理功能[5]。因此，抗性淀粉是一種新型的食品配料，以單獨的添加方式應用于食品配方中，是食用纖維及加工食品的理想材料[6]。至今抗性淀粉沒有特別精確的分類，目前大體上將其分為四大類：RS1（物理包埋淀粉），指淀粉酶無法接近的淀粉，主要存在于完整或部分研磨的谷粒、豆粒之中。RS2（抗性淀粉顆粒），指未經糊化的生淀粉粒和未成熟的淀粉粒，常存在于生馬鈴薯、生豌豆、綠香蕉中。RS3（回生淀粉），指糊化后的淀粉在冷卻或儲存過程中部分重結晶，是凝沉的淀粉聚合物，常存在于冷米飯、冷面包、油炸土豆片中。RS4（化學改性淀粉），是指由基因改造或化學改性引起淀粉分子結構發生變化從而產生抗酶性的一類抗性淀粉，如交聯淀粉、接枝頻率較高的接枝共聚淀粉等[7]。近年來，化學改性淀粉品種越來越多，其在食品中的用途也越來越廣泛。在化學改性淀粉中，檸檬酸酯化是常用的方法之一。在國內，王凱等對檸檬酸酯淀粉制備方法進行了一定的研究[8]，而這些研究多集中于對原淀粉的檸檬酸酯化處理及相關性質的研究，而對預糊化淀粉的檸檬酸酯化研究較少，特別是采用高直鏈玉米淀粉先進行預糊化然后再進行檸檬酸酯化的研究則鮮見報道。

1 材料與方法

1.1 主要材料

高直鏈玉米淀粉：澳大利亞Ingredion公司；檸檬酸：天津大學科威公司；氫氧化鈉：天津市科密歐化學試劑有限公司；無水乙醇：天津市風船化學試劑科技有限公司；葡萄糖測定試劑盒：長春匯力生物技術有限公司。

1.2 主要儀器

G/54TW型立式壓力蒸汽滅菌器、GZX-9146MBE型電熱鼓風干燥箱：上海博迅實業有限公司；TGL-16A型醫用離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；PL203型電子天平：梅特勒-托利多公司；SU-1510型掃描電子顯微鏡：日本日立公司；Vector22型傅里葉變換紅外光譜：德國Bruker；AQ5000型熱重分析儀：美國TA公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 預糊化淀粉的制備

稱取高直鏈玉米淀粉75 g，加入蒸餾水500 mL（配成15%的淀粉懸液），放置于500 mL的錐形瓶中，然后在121℃高壓滅菌鍋中處理30 min使其糊化后再在室溫下放置12 h，以此操作循環3次。將制備好的預處理淀粉懸液置于均質機中，攪勻，使其呈現糊狀。然后將樣品放于10 000 r/min的離心機中離心10 min，倒掉上清，向沉淀中加入60%的乙醇，再次離心倒掉上清，然后再向沉淀中加入無水乙醇，離心倒掉上清，留取沉淀物，在通風廚下自然風干，粉碎。

1.3.2 檸檬酸酯化淀粉的制備

稱取等量的原淀粉和預糊化淀粉，再以淀粉：檸檬酸的質量比為5∶2的比例混合，加入適量的蒸餾水，用10 mol/L的NaOH調節pH至3.5，待其完全溶解后，在室溫下放置12 h，然后在50℃烘干12 h。取出干燥的樣品，分別于110、130、150℃熱處理3 h，用無水乙醇洗滌3次，30℃下烘干過夜，研磨碎過篩（400 nm）。

1.3.3 取代度的測定

準確稱取2g樣品（W1）。加入2mL蒸餾水和50mL 1 mol/L的KOH溶液，在沸水浴中加熱10 min，待其冷卻至室溫，再用5 mol/L醋酸緩沖液調節pH至8.5，然后加入25 mL pH=8.5的硼酸鹽緩沖液和0.3 g指示劑（紅紫氨酸和Na2SO4以體積比為1∶500的比例混合），加入蒸餾水定容至300 mL，最后用0.05 mol/LCuSO4溶液滴定至紅色消失，記下所用溶液的體積V1（mL）。

空白試驗：準確稱取折算成絕干樣的原淀粉約2 g（記為W2）。利用上述測定步驟，記錄用去的0.05 mol/L CuSO4標準溶液的體積為V2（mL）。

式中：162為淀粉相對分子質量；A為樣品中檸檬酸?；|量分數，%；M為淀粉相對分子質量，175.1。

1.3.4 消化性測定

根據周中凱等采用的淀粉消化性方法[9]，并加以改進。準確稱量200 mg的樣品于100 mL錐形瓶中；加入300 μL唾液淀粉酶溶液（300 μL α-淀粉酶液溶于25 mL pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中。α-淀粉酶活力2 000 U/g），震蕩5 min；加入15 mL胃蛋白酶（250 mg豬源胃蛋白酶溶于0.02 mol/mL的鹽酸中，配成1 mg/mL質量濃度的溶液），放于水浴恒溫震蕩器（130 r/min）中37℃下反應30 min。在反應混合物中加入15 mL 0.02 mol/mL氫氧化鈉溶液（將純度96%的固體氫氧化鈉0.208 3 g溶解于250 mL蒸餾水中）；加入25 mL無酶醋酸鈉緩沖溶液后，再加入10 mL復合酶溶液（淀粉酶600 μL，糖化酶100 μL用pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液定容于50 mL容量瓶）。在37℃下繼續反應12 h，然后在不同時間吸取一定的反應液用葡萄糖氧化酶法測定不同樣品在不同時間反應液中葡萄糖含量，再利用公式C樣品=（A樣品/A標準品）×C標準品，（式中：A樣品為測定出樣品管的吸光度值；A標準品為測定出標準管的吸光度值；C標準品為標準液濃度即5.5 mmol/L）計算出樣品中葡萄糖濃度。

同時收集不同時間段反應液中的殘渣，用95%的酒精清洗2次，用于淀粉形態分析。

1.3.5 觀察淀粉顆粒形貌

利用掃描電子顯微鏡對淀粉樣品顆粒的外貌形態進行觀察。將不同樣品以及不同消化時期的樣品干燥粉碎后，均勻的灑在在帶有雙面膠的圓形面盤上，用Hitachi 1B-3離子涂布器噴金鍍膜，然后置于掃描電子顯微鏡下觀測[10]。每種淀粉的顆粒形態記錄3次。

1.3.6 檸檬酸酯化淀粉結構分析

淀粉樣品的傅里葉變換紅外光譜分析借鑒Sevenou的試驗方法[11]進行，并作適當修改。掃描光譜范圍為3 600 cm-1～600 cm-1，分辨率為4 cm-1，傅里葉變換紅外光譜為Varian7000FTIR，采用DTGS檢測器，衰減全反射（ATR）附件為MIRacleTM晶片和數顯高壓鉗。取1 mg樣品在紅外燈的照射下，置于瑪瑙研缽中研磨，研磨后與150 mg左右干燥的溴化鉀粉末充分混合，繼續研磨后壓片，取出樣品薄片，放入樣品架上，置于紅外光譜儀內波長為4 000 cm-1～500 cm-1掃描，繪制紅外光譜圖，利用Varian Resolutions Pro軟件進行基線修訂并處理得到圖譜。

1.3.7 熱重分析

稱取樣品5 mg～7 mg，將空托盤放入熱重分析儀去皮后加入樣品，以10℃/min的速率升溫，溫度范圍為20℃～600℃，測得TG曲線，再用Origin軟件對其進行分析[12]。

2 結果與討論

2.1 熱處理溫度對取代度的影響

酯化溫度對不同淀粉底物產生不同的影響見圖1。

圖1 不同溫度制備的檸檬酸酯化淀粉取代度的測定Fig.1Determination of the degree of substitution of citric acid ester starch prepared by different temperature

由圖1可見，從110℃升至130℃時，原淀粉的酯化取代度未發生變化，而對預糊化淀粉而言其酯化度呈現顯著提高，說明預糊化處理提高了淀粉對酯化處理的敏感性。當溫度進一步提升至150℃時，兩種淀粉底物的酯化程度相比低溫下均有明顯的提升。這可能是由于，隨著酯化溫度的不斷提高，檸檬酸分子內相鄰的兩個羧基會發生分子內的脫水，可以生成與淀粉發生反應的酸酐，導致分子內再次脫水，提高了反應的交聯作用[13]。當溫度達到150℃時，相比較原淀粉的DS值（0.150）而言，預糊化淀粉的DS值可高達0.328?？紤]到在150℃處理下兩種淀粉均可獲得最大的取代度，因此在下面分析中均采用150℃處理的酯化淀粉。

2．2不同淀粉底物消化率分析

不同檸檬酸酯化淀粉消化性的測定見圖2。

圖2 不同檸檬酸酯化淀粉消化性的測定Fig.2Determination of the digestibility of starch with different citric acid

從圖2可以看出，隨著消化時間的推移，在前4個小時樣品濃度均不斷提高，消化性增加，并在10 h～ 12 h達到平穩期。圖2顯示，預糊化高直鏈淀粉的消化速率和消化程度遠高于其對應的原淀粉，說明了預糊化過程對淀粉結構的影響，可能是在制備預糊化淀粉的過程中經過高溫高壓處理后，樣品的晶體區域被轉變為非晶體區域或片晶[14]。對原淀粉而言，檸檬酸酯化處理對其消化性質未見明顯影響，而對于預糊化處理的高直鏈淀粉經酯化處理后，其消化率由4個樣品中消化率最高（64.9%）遷移成消化率為最低（12.6%）。不同檸檬酸酯化淀粉的消化率見圖3?？芍?，這種低消化率可能與其高取代度有關，檸檬酸酐的存在可能在分子構象上影響到消化酶與底物的有效結合，阻礙了淀粉酶的攻擊[15]，從而影響到其最終的消化率。

2.3 酯化和消化對淀粉形態的影響

2.3.1 預糊化和酯化過程對淀粉形態的影響

預糊化前后和酯化前后淀粉的掃描電鏡圖見圖4。

圖3 不同檸檬酸酯化淀粉的消化率Fig.3Digestibility of starch by esterification of citric acid and citric acid

圖4 預糊化前后和酯化前后淀粉的掃描電鏡圖Fig.4Scanning electron microscopy of starch before and after pre-and after esterification

從圖4中可以看出，原淀粉呈非常規則的圓形，表面光滑。預糊化處理導致其形態成為無規則型，并且顆粒粘連在一起，進一步說明淀粉發生糊化行為[16]。顯然酯化處理對淀粉形態的影響更為明顯，導致原淀粉的形態發生了微小程度的變化，但對預糊化淀粉而言，酯化處理導致其外形發生了明顯改變，呈現出不規則的棱形結構，可能是由于在樣品制備過程中增加的檸檬酸造成了顆粒表面結構的變化，其表面呈現出明顯的被侵蝕的痕跡，這說明了檸檬酸對淀粉表面具有附著作用，并且它們發生交聯作用使其粘連在一起。

2.3.2 消化對淀粉形態的影響

無論是檸檬酸酯化的原生淀粉還是預糊化淀粉，與消化前相比淀粉其顆粒呈現出不同的形貌見圖5。

圖5 不同淀粉消化前后的掃描電鏡圖Fig.5Scanning electron microscope before and after digestion of different starch

如圖5所示，消化后的淀粉表面均有明顯的孔隙和凹陷，這是由于消化酶經過表面消化逐步向內部侵蝕作用造成的[17]。而消化導致淀粉顆粒表面孔隙和凹陷更加明顯，這可能是由于預糊化以后的淀粉表面較為粗糙更有益于使檸檬酸在與淀粉的交聯過程中附著作用，所以檸檬酸酯化預糊化淀粉的表面附著了更多的檸檬酸，在一定程度上可以阻礙消化酶對淀粉樣品的作用，從而使消化酶在其表面的作用點變少，表面多孔的結構形態被降低[18]，以至于降低了消化酶進入淀粉顆粒內部的可能性。

2.4 傅立葉變換紅外光譜分析

不同淀粉樣品的FTIR圖見圖6。

圖6 不同淀粉樣品的FTIR圖Fig.6FTIR maps of different starch samples

如圖6所示，預糊化淀粉與原淀粉的紅外光譜圖十分相似，只發生了細微的變化，說明高溫高壓處理僅僅是改變了淀粉樣品的結構形態，對其內部結構的理化性質并未有顯著影響。而經過檸檬酸酯化處理的淀粉紅外光譜與原淀粉相比有了顯著的變化，分別在2 338.08 cm-1、2 337.86 cm-1處有較明顯的吸收峰，說明淀粉與檸檬酸發生了交聯反應，并在酯化過程中產生了酯基。另外，檸檬酸酯化處理的預糊化淀粉與原生淀粉相比，在3 439.48 cm-1處的峰明顯高于檸檬酸酯化原生淀粉在紅外的吸收峰（3 423.70 cm-1），且在2 854.38 cm-1處出現一個新的吸收峰，可能淀粉中羥基更多地被檸檬酸根所取代。同時，該研究也表明酯化度愈高，其消化率愈低，抗消化性更強。

2.5 熱重分析

不同樣品熱重分析見表1。

表1 不同樣品熱重分析Tabel 1Thermal gravimetric analysis of different samples

由表1可以得出，原淀粉有兩段失重區域，在37℃～90℃為第一段失重，其失重率僅為6.856%，這主要是由于易揮發物質的蒸發所致，主要為水分的蒸發。第二階段失重發生在250℃～335℃，這一區間的失重率為67.74%，可能是由于淀粉自身的熱降解所致，在這一階段C-C-H、C-O和C-C鍵發生斷裂，主鏈也發生斷裂[19]。預糊化淀粉與原淀粉類似，也有兩段失重區域，自身熱降解發生在249℃～349℃，這一區域的失重率為72.34%，比其對應的原淀粉略高，水分的蒸發區域發生在50℃～102℃，失重率為6.68%。檸檬酸酯化原淀粉雖然同樣也有兩段失重階段，但是失重率和降解溫度均低于原淀粉和預糊化淀粉，其主要失重溫度在190℃～385℃，在該區域的失重率為59.53%，可能是淀粉自身分子鏈的斷裂以及葡萄糖單元的熱分解所致，水分蒸發的區域發生在38℃～104℃，失重率僅為3.140%。檸檬酸酯化預糊化淀粉也有兩段失重區域，但與檸檬酸酯化原淀粉相比，第一階段失重溫度在206℃～328℃，這一區間的失重率達到51.15%，在430℃～490℃的失重率為15.94%。結果表明預糊化淀粉經過檸檬酸酯化以后其熱分解溫度升高，淀粉的熱穩定性增強。

3 結論

通過本文初步研究了酯化溫度對兩種不同高直鏈淀粉酯化度的影響，結果表明預糊化處理顯著提高，由原淀粉的DS（0.151）提高至DS（0.333），其消化率由原來的63.5%降低至12.9%，而本研究也發現檸檬酸酯化對高直鏈原淀粉的消化率并無顯著影響。另外，預糊化導致的高酯化程度也采用了FTIR做了進一步證實。熱重分析表明，預糊化處理導致淀粉失重率提升，但檸檬酸酯化將顯著降低其失重率，說明其熱穩定性明顯提高，此研究內容為進一步提高淀粉中抗性淀粉含量及熱穩定性提供了一定的指導作用。

[1]李煥霞,任志,王華,等.我國膳食纖維研究現狀分析[J].中國食品添加劑,2007,25(6)：161-164

[2]孫元琳,李文多.谷物膳食纖維制備及應用研究綜述[J].鄭州輕工業學院學報(自然科學版),2012,27(1)：21-25

[3]薛山.新型膳食纖維——抗性淀粉在食品工業中的應用及前景[J].中國高新技術企業,2009,26(3)：85-88

[4]陳光,高俊鵬,王剛,等.抗性淀粉的功能特性及應用研究現狀[J].吉林農業大學學報,2005,27(5)：578-581

[5]翟愛華,呂博華,張洪微.抗性淀粉的研究現狀[J].農產品加工·學刊,2009(2)：22-25

[6]Sevenous,Hillse,Farhatia et al．Organisation of theeternal regin of the starch granules as determind by infrared spectroscopy[J]．IntJ Biol Macromol,2003,31(1/3)：79-85

[7]姚蕊,張守文.抗性淀粉的研究發展現狀與前景[J].糧食與食品工業,2006,13(1)：30-33

[8]王愷,李書華.檸檬酸酯淀粉最佳制備條件的研究[J].食品與機械,2011(7)：140-159

[9]周中凱,鄭排云,陳曉姍.緩速消化小麥淀粉物化特征及其消化特性的研究[J].食品工業,2014,26(9)：177-180

[10]楊蔚寧,談應權,陳培榮,等.高直鏈玉米淀粉的特性及其醋酸酯化改性的研究[J].安徽農業大學學報,2009,36(1)：63-67

[11]高群玉,李云云.甘薯抗性淀粉RS4的制備及理化性質的研究[D].廣州：華南理工大學,2013：1-68

[12]L Bjorck,A Gunnarsson,K Ostergard.A study on native andchemically modified potato starch.Part II.Digestibility in the rat intestinal tract[J].Starch,1989,41：128-134

[13]Pham Van Hunga,Ngo Lam Viena,Nguyen Thi Lan Phib.Resistant starch improvement of rice starches under a combination of acid and heat-moisture treatments[J].Food Chemistry,2016,191：67-73

[14]Sang Ick Shin,Chang Joo Lee,Mi Jung Kim,et al.Structural characteristics of low-glycemic response rice starch produced by citric acid treatment[J].Carbohydrate Polymers,2009(5)：588-595

[15]高俊鵬,陳光.抗性淀粉的制備工藝及理化性質的研究[D].吉林：吉林農業大學,2012：1-72

[16]L Bjorck,A Gunnarsson,K Ostergard.A study on native and chemically modified potato starch.Part II.Digestibility in the rat intestinal tract[J].Starch,1989,41：128-134

[17]于九皋,于密軍.檸檬酸改性豌豆淀粉的研究[D].天津：天津大學, 2008：1-58

[18]周中凱,張巖,陳曉姍,等.波譜特性與淀粉消化行為的關系[J].糧食與飼料工業,2013,24(7)：15-21

[19]Bingham S,Day N,Dietary fibre in food and protection against colorectal cancer in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition(EPIC)：an observationa[J].Lancet,2003,361(3)：1496-1501

Effect of Citric Acid Esterification on the Properties of the Raw Starch and Pre-paste Starch

ZHOU Zhong-kai，YANG Rui，SHEN Xiao-yu
（Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

High amylose corn starch as raw material，through the heat treatment preparation of pregelatinized starch，and citric acid were esterified.Using in vitro model，Fourier transform infrared spectrometer（FTIR），scanning electron microscopy（SEM）and thermogravimetric analysis（TG）of two straight chain starch properties high difference method.The results showed that compared with the raw starch，pregelatinized starch more significantly improve the degree of esterification and reduced its digestibility.Comparison of two kinds of esterified starch，citric acid esterification pregelatinized starch will lead than raw starch citric acid esterification were lower the rate of digestion，the low digestibility was associated with high degree of substitution，its relevance was verified by absorption characteristics of Fourier transform infrared spectroscopy.At the same time，TG analysis showed that citric acid esterification of pregelatinized starch and its thermal decomposition at high temperature，Thermal stability was stronger.These structural characteristics may be related to its low digestibility.The further study of this study had a certain guiding significance for the further improvement of resistant starch content in starch.

high amylose corn starch；resistant starch；citric acid esterification；anti digestion

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.002

2016-08-10

科技部農業科技成果轉化（2014GB2A100527）；國家自然科學基金（31471701）

周中凱（1964—），男（漢），教授，博士，研究方向：谷物科學與營養。