甘蔗汁多酚氧化酶的提取研究

林波，鄭鳳錦，方曉純，孫健，陳趕林

（1.廣西大學(xué)，廣西南寧530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西南寧530007；3.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣西南寧530007）

甘蔗汁多酚氧化酶的提取研究

林波1，2，鄭鳳錦2，方曉純2，孫健2，陳趕林3，*

（1.廣西大學(xué)，廣西南寧530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西南寧530007；3.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣西南寧530007）

以磷酸鹽緩沖液勻漿浸提法提取混合甘蔗汁多酚氧化酶（PPO），探討緩沖液pH值、表面活性劑添加量和聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）添加量對(duì)甘蔗汁PPO提取效果的影響。結(jié)果表明，以鄰苯二酚為底物時(shí)，獲得甘蔗汁PPO的酶活性最適測(cè)定波長(zhǎng)是230 nm。磷酸鹽緩沖液提取甘蔗汁PPO最適pH值為6.2；在磷酸鹽緩沖溶液中PVPP最適添加量為2%，提取甘蔗汁PPO的比活性最高。在緩沖液中加入表面活性劑Tween80和TritonX-100時(shí)，提取甘蔗汁PPO的比活性較低。

甘蔗汁；多酚氧化酶；提取；活性

廣西是國(guó)內(nèi)最大的甘蔗種植區(qū)和產(chǎn)糖區(qū)，甘蔗含糖量高，其糖分由蔗糖、果糖、葡萄糖3種成分構(gòu)成，約占18%～20%，是主要的制糖原料。此外，甘蔗還含有天門冬酸、天門冬氨酸、丙氨酸、檸檬酸、維生素A、維生素C、尼克酸、核黃素及鐵、鈣、磷、錳、鋅等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中鐵含量為9 mg/kg，居水果之首[1-2]。醫(yī)學(xué)研究表明，甘蔗汁中富含多酚和黃酮類物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化能力、抗突變能力、抗炎能力以及酪氨酸酶抑制能力[3-4]。

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，簡(jiǎn)稱PPO）是果蔬體內(nèi)普遍存在的一類含銅的氧化還原酶。果蔬組織中發(fā)生的褐變現(xiàn)象主要是由于PPO催化富含在果蔬中的酚類物質(zhì)的氧化反應(yīng)所引起的[5]。由于PPO廣泛分布于植物界乃至動(dòng)物界，且其檢測(cè)方法方便快捷，因此，對(duì)于果蔬PPO的提取、純化及其特性等，國(guó)內(nèi)外學(xué)者們展開了大量的研究以及應(yīng)用。

學(xué)者們對(duì)楊桃[5]、蘋果[6]、香蕉[7]、蜜柚[8]、木瓜[9]等果蔬的PPO進(jìn)行了很多研究，到目前為止，對(duì)甘蔗PPO的研究都大多是在甘蔗組織培養(yǎng)和生理等領(lǐng)域，對(duì)控制甘蔗發(fā)酵防止酶促褐變的研究極少，前期何思蓮[10]對(duì)甘蔗PPO的提取分離工藝僅做了初步研究，本試驗(yàn)在其基礎(chǔ)上，對(duì)新鮮混合甘蔗汁PPO進(jìn)行提取研究，考察提取因素對(duì)甘蔗汁PPO的影響，為今后甘蔗汁深加工中抑制酶促褐變提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮混合甘蔗汁（已壓榨好的糖料甘蔗蔗汁，甘蔗品種為桂糖系列品種）：2015年11月由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所提供；Tween80、TritonX-100、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、鄰苯二酚：國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PGL精密天平：深圳市怡華新電子有限公司；B4-1A磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司；3K-15高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)SIGMA離心機(jī)有限公司；GENESYS 10S紫外可見分光光度計(jì)：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甘蔗汁PPO的提取方法

在冷藏（4℃）后的新鮮混合甘蔗汁中加入預(yù)冷（4℃）過的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）和聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），振蕩混勻30 min后在9 500 r/min、4℃下離心30 min，收集上清液，上清液即為甘蔗汁PPO粗酶液。

1.3.2 甘蔗汁PPO活性最適波長(zhǎng)的測(cè)定

參考Yang等[11]報(bào)道的分光光度計(jì)比色法進(jìn)行測(cè)定。酶反應(yīng)混合液由3.9 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.1mol/L，pH值7.0）、1 mL鄰苯二酚（0.01 mol/L）和0.1 mL酶液組成。將混合液在30℃下反應(yīng)5 min，在波長(zhǎng)200 nm～600 nm掃描范圍內(nèi)測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物吸光度值的變化，將最大吸收峰處的波長(zhǎng)確定為測(cè)定甘蔗汁PPO的最適波長(zhǎng)。

1.3.3 甘蔗汁PPO活性測(cè)定

按照1.3.1方法提取甘蔗汁PPO酶液。將混合液在30°C下反應(yīng)5 min，在最適波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物吸光值的變化。將1 mL酶液反應(yīng)后1 min吸光度值（OD230）增加0.01定義為1個(gè)酶活性單位（1 U）。

1.3.4 甘蔗汁PPO蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

按照1.3.1方法提取甘蔗汁PPO酶液。參考《果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》果蔬中可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定——考馬斯亮藍(lán)染色法[12]。

1.3.5 甘蔗汁PPO比活性

比活性是1 mg酶蛋白所具有的酶活性單位數(shù)，一般用U/mg蛋白來表示。酶的比活性越高，其純度越高。計(jì)算公式為：

比活性=酶活性單位數(shù)（U）/蛋白質(zhì)含量（mg）

1.3.6 提取因素對(duì)甘蔗汁PPO提取的影響

1.3.6.1 緩沖液pH對(duì)甘蔗汁PPO提取的研究

分別配制pH值為6.0～7.2（以0.2為間隔）的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，使用上述提取條件提取甘蔗汁PPO酶液，進(jìn)行酶的比活性的測(cè)定與比較。

1.3.6.2 添加表面活性劑對(duì)甘蔗汁PPO提取的研究

在pH值7.0的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中，分別添加1%、2%、3%的Tween 80和1%、2%、3%的Triton X-100，提取甘蔗汁PPO酶液，進(jìn)行酶的比活性的測(cè)定與比較。

1.3.6.3 不同添加量的PVPP對(duì)甘蔗汁PPO提取的研究

在pH值7.0的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中，分別加入0%、1%、2%、3%、4%、5%的PVPP，提取甘蔗汁PPO酶液，進(jìn)行酶的比活性的測(cè)定與比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定甘蔗汁PPO活性的最適波長(zhǎng)

按照上述方法提取甘蔗汁的粗酶液，將混合液在30℃下反應(yīng)5 min，在波長(zhǎng)200 nm～600 nm范圍內(nèi)掃描混合反應(yīng)液，測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物吸光度值的變化，將最大吸收峰處的波長(zhǎng)確定為測(cè)定混合甘蔗汁PPO的最適波長(zhǎng)，結(jié)果見圖1。

圖1 甘蔗汁PPO與鄰苯二酚作用后產(chǎn)物的吸收峰Fig.1Absorption peaks of PPO and catechol in sugarcane juice

從圖1可見，通過波長(zhǎng)掃描反應(yīng)液，在230 nm和290 nm處出現(xiàn)兩個(gè)紫外吸收峰，尤其是230 nm處吸收峰最高，較明顯；而290 nm處的吸收峰較小，這可能是其他酶類與底物鄰苯二酚反應(yīng)的結(jié)果。何思蓮[10]報(bào)道以鄰苯二酚為底物，甘蔗PPO提取物與底物反應(yīng)所得產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)為410 nm，與本試驗(yàn)使用相同的底物，但得到不同的酶促反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)，這可能是由于使用不同的原料，報(bào)道中使用的原料是臺(tái)糖22甘蔗品種，而本試驗(yàn)中使用的是桂糖系列品種且新鮮壓榨并混合的甘蔗汁，每個(gè)甘蔗品種的PPO含量不一樣，這可能造成使用相同的底物，但測(cè)定得到不同的最大吸收波長(zhǎng)。同時(shí)，為了觀察熱處理后甘蔗PPO的變化，對(duì)煮沸后的甘蔗汁PPO也進(jìn)行測(cè)定，以鄰苯二酚為底物測(cè)定酶促反應(yīng)產(chǎn)物最大吸收波長(zhǎng)也是在230 nm處。

由此可知混合甘蔗汁PPO與底物鄰苯二酚作用后的產(chǎn)物最大吸收峰出現(xiàn)在230 nm處。表明以鄰苯二酚為底物時(shí)，甘蔗汁PPO的酶活測(cè)定的最適波長(zhǎng)是230 nm。

2.2 緩沖液pH值對(duì)甘蔗汁PPO提取的影響

以不同pH值（6.0～7.2，以0.2為間隔）的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，按照1.3.1提取方法，提取混合甘蔗汁PPO酶液，進(jìn)行酶的比活性的測(cè)定與比較，結(jié)果見圖2。

圖2 不同pH值的磷酸鹽緩沖液對(duì)甘蔗汁PPO提取的影響Fig.2Effect of phosphate buffer with different pH value on extraction of PPO from sugarcane juice

從圖2可見，在測(cè)定波長(zhǎng)為230 nm，以pH 6.0～7.2的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液作為提取液的條件下，甘蔗汁PPO的比活性隨著pH值的增加而降低，在pH 6.0時(shí)，提取甘蔗汁PPO的比活性最大；從pH 6.2開始，甘蔗汁PPO的比活性開始降低；在pH 6.4～7.0時(shí)，提取的甘蔗汁PPO比活性相差不多；在pH 7.2時(shí)，提取的甘蔗汁PPO比活性最低。這表明PPO的溶解度和穩(wěn)定性與磷酸鹽緩沖液的pH值有關(guān)，pH值過高或過低都不利于甘蔗汁PPO的提取，但與測(cè)定的波長(zhǎng)關(guān)系不大，綜合考慮下，提取甘蔗汁PPO的最適pH值為6.2。

2.3 添加表面活性劑對(duì)甘蔗汁PPO提取的影響

按照1.3.1提取方法，在pH 7.0的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中添加表面活性劑提取混合甘蔗汁PPO酶液，進(jìn)行酶的比活性的測(cè)定與比較，結(jié)果見表1。

從表1可知，添加表面活性劑對(duì)甘蔗汁PPO的提取有顯著的影響。添加表面活性劑Tween 80和Triton X-100的酶活性U和酶液比活性都隨著表面活性劑濃度的增加而降低，而可溶性蛋白質(zhì)的含量卻隨著濃度的增加而增加，這可能是表面活性劑提高了其他雜蛋白的提取；對(duì)比兩種表面活性劑對(duì)甘蔗汁PPO提取的效果，濃度1%～2%Tween 80表面活性劑比Triton X-100表面活性劑的提取效果要好一些，酶活性U和比活性的數(shù)值要高一些，但比活性都比未添加表面活性劑的CK處理數(shù)值低，由此可見，添加表面活性劑的濃度應(yīng)在最適范圍之內(nèi)。

表1 添加表面活性劑對(duì)甘蔗汁PPO提取的影響Table 1Effect of surfactant addition on PPO extraction of sugarcane juice

2.4 不同PVPP添加量對(duì)甘蔗汁PPO提取的影響

按照1.3.1提取方法，在pH 7.0的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中，加入不同添加量的PVPP，對(duì)甘蔗汁PPO酶液提取，進(jìn)行酶的比活性的測(cè)定與比較，結(jié)果見圖3。

圖3 不同添加量的PVPP對(duì)甘蔗汁PPO提取的影響Fig.3Effect of PVPP with different dosage on the extraction of PPO from sugarcane juice

由圖3可見，在磷酸鹽緩沖溶液中，加入不同添加量的PVPP影響甘蔗汁PPO酶液的提取效果。其中添加量為2%的PVPP提取甘蔗汁PPO的比活性最高，這可能是PVPP通過與甘蔗汁中的多酚類物質(zhì)形成氫鍵絡(luò)合物沉淀下來，并吸附些雜蛋白，從而提高酶液的比活性；而當(dāng)PVPP的添加量增加時(shí)，甘蔗汁PPO的比活性也隨之降低。可見，在波長(zhǎng)230 nm處，磷酸鹽緩沖溶液中PVPP的最適添加量為2%，提取甘蔗汁PPO的比活性最高。這方法比何思蓮[10]的報(bào)道中使用吸光度值法測(cè)定PVPP澄清的提取液，提取效果更明顯，更有效地說明PVPP最適添加量為2%，同時(shí)也說明使用不同波長(zhǎng)（420 nm和230 nm）測(cè)定甘蔗汁PPO中PVPP的添加量都為2%，不同的波長(zhǎng)掃描測(cè)定對(duì)PVPP添加量的影響不大，PVPP添加量對(duì)植物液中的多酚類物質(zhì)和蛋白質(zhì)具有較好的吸附作用。

3 結(jié)論

在以磷酸鹽緩沖液勻漿浸提法提取混合甘蔗汁PPO時(shí)，考察緩沖液的pH值、表面活性劑和PVPP的不同添加量對(duì)混合甘蔗汁PPO提取效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，以鄰苯二酚為底物時(shí)，混合甘蔗汁PPO酶促反應(yīng)測(cè)定的最適波長(zhǎng)為230 nm。在酶促反應(yīng)產(chǎn)物最大吸收波長(zhǎng)230 nm處，磷酸鹽緩沖液提取混合甘蔗汁PPO的最適pH為6.2，PVPP最適添加量為2%，提取混合甘蔗汁PPO的比活性最高。在緩沖液中加入表面活性劑Tween 80和Triton X-100的提取效果都比未加入表面活性劑的要低些，故在使用磷酸鹽緩沖液勻漿浸提法時(shí)不宜加入表面活性劑提取混合甘蔗汁PPO。

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The Extraction of Polyphenol Oxidase from Sugarcane Juice

LIN Bo1，2，ZHENG Feng-jin2，F(xiàn)ANG Xiao-chun2，SUN Jian2，CHEN Gan-lin3，*
（1.Guangxi University，Nanning 530007，Guangxi，China；2.Agro-food Science and Technology Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，Guangxi，China；3.Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，Guangxi，China）

Polyphenol oxidase（PPO）was extracted from mix sugarcane juice by phosphate buffer homogenate extraction.The effects of pH value，surfactant adding quantity and polyvinyl polypyrrolidone（PVPP）adding quantity on the PPO extraction were determined.The results showed that the optimal wavelength of enzymatic activity of PPO was 230 nm when catechol was used as substrate.The optimal pH value of PPO was 6.2.The optimal adding quantity of PVPP was 2%in phosphate buffer solution，and the highest specific activity of PPO was obtained in sugarcane juice.When adding surfactant Tween 80 and Triton X-100 in buffer，the specific activity of PPO in extracting sugarcane juice was low.

sugarcane juice；polyphenol oxidase；extraction；activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.011

2017-01-18

國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2015GA790013）；廣西科技計(jì)劃項(xiàng)目（桂科AB16380244，桂科合14123001-10）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)（桂農(nóng)科2015YZ02）

林波（1987—），女（漢），助理工程師，研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與產(chǎn)品開發(fā)研究工作。

*通信作者：陳趕林（1980—），男（漢），副研究員，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與綜合利用研究工作。