響應(yīng)面法優(yōu)化巴旦木總黃酮提取工藝研究

梁鵬舉，姜建輝，*，陳敏

（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.新疆兵團(tuán)南疆化工資源利用工程實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

響應(yīng)面法優(yōu)化巴旦木總黃酮提取工藝研究

梁鵬舉1，2，姜建輝1，2，*，陳敏1，2

（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.新疆兵團(tuán)南疆化工資源利用工程實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對巴旦木總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。巴旦木總黃酮最佳提取工藝條件為：提取時(shí)間為60min，料液比1∶21（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)73%。理論預(yù)測值為4.093mg/g，實(shí)際測量值為4.090 mg/g。實(shí)際優(yōu)化的工藝條件與理論預(yù)測擬合程度高。

巴旦木；響應(yīng)面；總黃酮；提取

巴旦木又名巴旦杏（Amygdalus communis L.），因其形扁如桃，又名扁桃，維吾爾語為巴旦姆，英文名Almond tree，薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）喬木，是世界重要干果及木本油料樹種之一[1]。巴旦木營養(yǎng)價(jià)值極高，為不可多得的滋補(bǔ)佳品，有“圣果”之稱，是維吾爾族最重要的干果品種，已成為南疆尤其是喀什和田地區(qū)的重要農(nóng)副產(chǎn)品。由于林果業(yè)作為南疆經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要抓手之一，巴旦木又是南疆最重要的果樹品種，對巴旦木的研究日益成為熱點(diǎn)[2-5]，但對巴旦木黃酮的研究還鮮見相關(guān)報(bào)道。以新疆喀什產(chǎn)巴旦木為原料，用醇提法研究了其總黃酮的提取工藝，利用單因素和響應(yīng)面對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析旨在為巴旦木產(chǎn)業(yè)的綜合發(fā)展和高價(jià)值加工提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴旦木：采購于新疆阿拉爾市江泰市場干果店，巴旦木果仁烘干去皮、粉碎、過40目篩，收集備用；蘆丁對照品（生物純、純度≥95%）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；石油醚、氫氧化鈉（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉（分析純）：上海試劑一廠；蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩：上虞市儀器設(shè)備廠；HHS電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；AL104電子天平：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；UV2400紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SK1515電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TD5Z醫(yī)用離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取巴旦木總黃酮的工藝流程

巴旦木干燥→粉碎（過40目篩）→石油醚脫脂→稱取1.0 g→在一定的提取時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度條件下進(jìn)行提取→抽濾→離心→定容→待測液。

1.3.2 測定波長的選擇及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考姜建輝等[6]方法選擇最佳波長，以蘆丁的質(zhì)量濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。做回歸處理，得回歸線方程為[7]y=8.500 0x+ 0.034 1，R2=0.999 6，線性范圍為8 μg/mL～40 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1Standard curve of rutin

1.3.3 總黃酮含量的計(jì)算

由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品溶液的濃度，再根據(jù)濃度計(jì)算總黃酮的含量：總黃酮提取量/（mg/g）=C×V×n/W。式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得的濃度，mg/mL；V為黃酮提液的體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；W為巴旦木粉末重量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取巴旦木粉末1.0 g，置于圓底燒瓶中，以提取時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度分別為單因素[8]，研究不同單因素對巴旦木總黃酮提取量的影響。

1.3.4.1 提取時(shí)間對巴旦木總黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱取巴旦木粉末1.0 g，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20（g/mL）、提取溫度70℃，提取時(shí)間為30、45、60、75、90 min的條件下進(jìn)行提取。

1.3.4.2 料液比對巴旦木總黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱取巴旦木粉末1.0 g，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、確定最優(yōu)的提取時(shí)間、提取溫度70℃，在料液比分別為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）的條件下進(jìn)行提取。

1.3.4.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱取巴旦木粉末1.0 g，確定最優(yōu)的提取時(shí)間、提取溫度70℃、最優(yōu)的料液比，在乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%的條件下進(jìn)行提取。

1.3.4.4 提取溫度對總黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱取巴旦木粉末1.0 g，確定最優(yōu)提取時(shí)間、最優(yōu)體積分?jǐn)?shù)、最優(yōu)料液比，在提取溫度分別50、60、70、80℃的條件下進(jìn)行提取。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

用Design-Expert軟件處理數(shù)據(jù)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[9]，選取提取時(shí)間（A）、料液比（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）為試驗(yàn)因素，以總黃酮提取量為響應(yīng)值，進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1Designed of the response surface of level of factor

1.3.6 巴旦木總黃酮提取的重復(fù)性試驗(yàn)

驗(yàn)證通過試驗(yàn)選定的最佳工藝重復(fù)性[6]，分別準(zhǔn)確稱取6份巴旦木粉末1.0 g，以上述過程選定的最佳提取工藝條件分別進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，顯色及測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間

提取時(shí)間對提取量的影響如圖2所示。

圖2 提取時(shí)間對總黃酮提取量的影響Fig.2Effect of extraction time on the flavones

巴旦木總黃酮的提取量是隨時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后減少的變化。這可能是由于隨著提取一定時(shí)間的增加，黃酮類化合物已基本被提取出來，繼續(xù)延長提取時(shí)間，黃酮結(jié)構(gòu)可能被破壞，并導(dǎo)致提取量下降[10]。由圖可知，總黃酮提取時(shí)間確定在60 min時(shí)提取量最高。

2.1.2 提取料液比

料液比對提取量的影響如圖3所示。

圖3 料液比對總黃酮提取量的影響Fig.3Effect of solid to liquid ratio on the flavones

巴旦木總黃酮的提取量在料液比1∶20（g/mL）時(shí)提取量最大。料液比反映了質(zhì)量濃度差，質(zhì)量濃度差越大，樣品中的黃酮溶出就越多，越有利于提高提取率。但是隨著溶劑用量的增大，提取量沒有增加，反而出現(xiàn)下降，并且會消耗大量的溶劑。故料液比1∶20（g/mL）為宜。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)

乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響如圖4所示。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響Fig.4Effect of the volume fraction of ethanol on the flavones

巴旦木總黃酮提取量在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)得率較低，巴旦木總黃酮提取量隨著乙醇體積的增大而增加，當(dāng)無水乙醇增大到體積分?jǐn)?shù)達(dá)70%時(shí)，巴旦木總黃酮的提取量也最高，繼續(xù)增加無水乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)巴旦木總黃酮提取量成直線下降趨勢，無水乙醇體積分?jǐn)?shù)高達(dá)90%時(shí)巴旦木總黃酮提取量最低。其原因可能是相似相溶原理，極性越接近溶解度越大，在乙醇濃度為70%時(shí)溶劑的極性和黃酮的極性最為接近。故乙醇體積分?jǐn)?shù)70%為宜。

2.1.4 提取溫度

提取溫度對總黃酮提取量的影響如圖5所示。

圖5 提取溫度對總黃酮提取量影響Fig.5Effect of extraction temperature on the flavones

溫度較低時(shí)所得巴旦木總黃酮的量較少，當(dāng)溫度逐漸升高，巴旦木總黃酮提取量隨溫度的變化呈近似于線性的趨勢逐漸增大，80℃時(shí)總黃酮提取量最大，這時(shí)提取液已沸騰，繼續(xù)升高溫度提取液的溫度也不會隨之升高，故最佳提取溫度選為80℃。

2.2 最佳提取工藝的研究

利用Box-Behnken組合設(shè)計(jì)原理，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件[11]，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取提取時(shí)間（A）、料液比（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）作為自變量，以巴旦木中所提取總黃酮量為響應(yīng)值。表2為試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理結(jié)果，表3為數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果。

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和計(jì)算結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。2.2.2響應(yīng)曲面分析

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2Designed and experiment result of response surface

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Continue table 2Designed and experiment result of response surface

對表2結(jié)果用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得二次回歸方程模型為：

表3 回歸方程方差分析Table 3Variance analysis of the equation of fitted regression model

由表3可知，回歸方程擬合檢驗(yàn)p＜0.000 1為高度顯著，失擬項(xiàng)p=0.148 9＞0.05不顯著，相關(guān)系數(shù)R2= 0.989 3，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.975 6，表明試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合度高，可用該模型預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。CV（變異系數(shù)）=1.33%，說明模型精確度高，重現(xiàn)性好，試驗(yàn)可信?？捎么四Ｐ蛯Π偷┠究傸S酮提取進(jìn)行預(yù)測。

通過模型的回歸方差分析（表3）可以看出，一次項(xiàng)B、C對粗提取率的影響顯著，二次項(xiàng)A2、B2對試驗(yàn)結(jié)果影響高度顯著，C2對試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著，AB、AC、BC交互效應(yīng)不顯著。從F值可知，巴旦木中總黃酮提取量受料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間的影響關(guān)系為：料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。提取時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量影響的響應(yīng)曲面圖見圖6。

圖6 提取時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量影響的響應(yīng)曲面圖Fig.6Responsive surfaces showing the effects of extraction temperature，solid to liquid and volume fraction of ethanol on the extraction yield of Amygdalus communis L.flavonoids

圖6是通過Design-Expert軟件以表2的試驗(yàn)結(jié)果和響應(yīng)方程所繪制的響應(yīng)曲面圖，直觀地描述了兩因素間的交互作用[13]。響應(yīng)面圖中圖形坡度越大代表相互作用越大，反之則越小[14]。由圖6分析可知，兩兩因素間對響應(yīng)值均有一定的交互作用，但交互作用相對較弱，其中AB的交互作用較為明顯，但未到顯著。

通過響應(yīng)面分析得到乙醇溶液提取巴旦木總黃酮的最優(yōu)工藝條件為提取時(shí)間60.32 min，料液比1∶20.89（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)72.80%，提取溫度80℃，在此條件下巴旦木總黃酮提取量理論值為4.093 mg/g?？紤]具體試驗(yàn)，將其最佳工藝條件優(yōu)化為提取時(shí)間60 min，料液比1∶21（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)73%，提取溫度80℃，在此條件下測得巴旦木中總黃酮的提取量高達(dá)4.090 mg/g，總黃酮提取量與巴旦木中總黃酮量的理論值相差較小，二者吻合性好，這很好的說明該模型的預(yù)測值與實(shí)際提取值具有良好的擬合度，可用該模型預(yù)測巴旦木總黃酮的提取，方法可靠、結(jié)果準(zhǔn)確。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

按選定的最優(yōu)條件及試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了6次重復(fù)性平行試驗(yàn)，在吸光度為0.313時(shí)，巴旦木總黃酮的平均提取量達(dá)4.093 mg/g，RSD為0.52%（n=6）。該工藝對從巴旦木中提取總黃酮的試驗(yàn)重復(fù)性好。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)曲面分析方法對巴旦木中總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合度好，誤差小，能夠較好地預(yù)測巴旦木總黃酮的提取率，該方法準(zhǔn)確可靠。確定巴旦木總黃酮提取的最佳工藝條件為提取時(shí)間60 min，料液比1∶21（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)73%，提取溫度80℃，在此最優(yōu)條件下，從巴旦木中提取總黃酮的理論值為4.093 mg/g，實(shí)際測得4.090 mg/g，與理論值比較吻合。

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Optimization of Extraction Technique of Total Flavonoids from Amygdalus communis L. Seed Kernel via Response Surface Methodology

LIANG Peng-ju1，2，JIANG Jian-hui1，2，*，CHEN Min1，2
（1.College of Life Sciences，Tarim University，Alar 843300，Xinjiang，China；2.Engineering Laboratory of Chemical Resources Utilization in South Xinjiang of Xinjiang Production and Construction Crops，Alar 843300，Xinjiang，China）

On the basis of mono-factor tests，the extraction technology of total flavonoids from Amygdalus communis L.seed kernel was optimized by response surface methodology.The optimum extraction conditions were as follows：the extraction time of 60 min，the solid-liquid ratio of 1∶21（g/mL）and the ethanol concentration of 73%．The predicted and actual yields of total flavonoids from Amygdalus communis L.seed kernel were 4.093 mg/g and 4.090 mg/g accordingly.The actual optimized conditions for polysaccharides extraction from Amygdalus communis L.seed kernel had a high fitting with theoretical prediction indicating its reliability.

Amygdalus communis L.seed kernel；response surface methodology；total flavonoids；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.012

2016-08-13

國家自然科學(xué)基金（31160074）

梁鵬舉（1984—），男（漢），講師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。

*通信作者：姜建輝，副教授，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。