龍眼殼黃酮的純化工藝研究

王俊，韓淑琴，*，李志銳，呂平

（1.中山職業(yè)技術學院，廣東中山528404；2.天津職業(yè)大學，天津300402）

龍眼殼黃酮的純化工藝研究

王俊1，韓淑琴1，*，李志銳1，呂平2

（1.中山職業(yè)技術學院，廣東中山528404；2.天津職業(yè)大學，天津300402）

采用AB-8大孔徑樹脂柱層析法對龍眼殼黃酮進行純化，對上樣量、pH值、洗脫液濃度等洗脫條件進行優(yōu)化，得最佳純化工藝條件為：上樣量為10 mL時，樣品濃度為0.264 mg/mL；pH值為3；洗脫液為90%的乙醇。同時對龍眼殼黃酮HPLC分析條件進行優(yōu)化，結果表明最優(yōu)分析條件為：流動相，甲醇-水（25∶75，體積比）；流速，0.5 mL/min；波長：254 nm；柱溫：25℃；進樣量：4 μL；在此條件下經柱層析法有效純化的龍眼殼黃酮樣品中蘆丁純度最高可達63.95%。

龍眼殼；黃酮；大孔徑樹脂；純化

龍眼（longgan）俗稱“桂圓”，是我國南方佳果。據文獻表明龍眼的莖、葉、花、果、殼中均含有豐富的黃酮、多酚、多糖類物質。龍眼殼“味甘、性溫、無毒”，“治心虛頭暈、散邪祛風、聰耳明目”，“研細治湯火傷亦佳”[1-2]。龍眼果實含有14%～22%的殼，每年在龍眼肉等龍眼制品的加工制作過程中，會產生大量的龍眼殼廢料，而龍眼殼中所含主要活性物質為黃酮類化合物[3-4]，對龍眼殼進行黃酮類物質的提取利用將大大提高龍眼的綜合經濟價值，大大提高龍眼種植業(yè)的經濟效益。黃酮類化合物具有抗氧化性[5]，抗癌，調節(jié)血脂、血糖[6]，抗抑郁[7]，改善血液循環(huán)[8]，鎮(zhèn)痛等等作用，在化妝品、保健食品和藥品中都應用廣泛，具有廣闊應用前景。本文采用AB-8大孔徑樹脂柱層析純化龍眼殼黃酮粗提物，以濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液為洗脫液梯度洗脫，得5個洗脫液樣本后采用高效液相法檢測純度，考察本方法的價值和可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍眼殼黃酮粗提物、無水乙醇、甲醇、AB-8大孔樹脂、蘆丁標準品：中國藥品與生物制品檢定所；氫氧化鈉、鹽酸等化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

玻璃層析柱：直徑2 cm，柱長32 cm；T6-紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀：中國上海新拓微波溶樣測試技術有限公司；DZF-6050B箱真空干燥器：上海一恒科學儀器有限公司；HP-1100高效液相色譜儀：美國惠普。

1.3 方法

1.3.1 龍眼殼黃酮粗提物制備

石峽龍眼果殼，低溫烘干后粉碎備用；精確稱取龍眼殼粉末5 g，70%的乙醇溶液：龍眼殼粉末，以液固質量比25∶1（mL/g）的比例浸泡1 h，后采用超聲微波協(xié)同萃取法提取。

提取工藝條件：提取時間一輪60 s，微波功率300 W、超聲波開啟，其中超聲微波開啟10 s后暫停10 s，第一次萃取完待萃取液冷卻后以同樣技術參數(shù)進行第二輪萃取；萃取完畢后過濾得龍眼殼黃酮粗提液，回收乙醇處理后，真空干燥得龍眼殼黃酮粗提物備用。

1.3.2 大孔徑樹脂的前處理

AB-8大孔徑樹脂，置于燒杯中加無水乙醇浸泡24 h，后用去離子水充分淋洗至無乙醇氣味，備用。采用流動法裝填大孔徑樹脂層析柱，裝填的過程中不斷敲擊柱壁使樹脂顆粒裝填嚴密無空隙。裝填高度達到要求后用去離子水過柱，使樹脂填充更加緊實。待層析柱穩(wěn)定后，備用。

2 結果與分析

2.1 大孔徑樹脂柱層析條件優(yōu)化

2.1.1 洗脫液濃度對黃酮含量的影響

將龍眼殼黃酮粗提物用30%乙醇溶液溶解定容至10 mL，上樣至大孔徑樹脂層析柱，待樣品加載完畢后，采用濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液各30 mL梯度洗脫，分段接收得1號～5號龍眼殼黃酮樣品，樣品經微孔濾膜過濾后冷藏待檢測。不同濃度乙醇洗脫所得樣品含量見表1。

表1 不同濃度乙醇洗脫所得樣品含量Table 1Sample content elution by different concentrations of ethanol

由表1數(shù)據可見采用AB-8大孔徑樹脂柱層析法對龍眼殼黃酮進行純化，以乙醇為洗脫劑，采用濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液各30 mL梯度洗脫，分段采集得5份純化樣品，樣品中蘆丁含量分別為：8.52%、9.98%、24.94%、48.99%、61.99%，呈梯度分布。結果表明用90%的乙醇溶液洗脫最好。

2.1.2 龍眼殼黃酮樣品上樣量對樹脂純化的影響

在樹脂中加入不同量的提取液，靜置60 min，測定流出液龍眼殼黃酮樣品的含量，結果如表2。

表2 不同上樣量對樹脂純化的影響Table 2Effects of different loading amount on resin purification

濃度在0.2 mg/mL～0.3 mg/mL范圍內龍眼殼黃酮樣品對樹脂的吸附效果最好，說明不同濃度的龍眼殼黃酮樣品對大孔樹脂吸附有影響，原因是樹脂的吸附能力是有限的，濃度過高，龍眼殼黃酮樣品超出了其吸附能力，有一部分龍眼殼黃酮樣品不能被吸附，所以含量反而降低，選擇合適的龍眼殼黃酮樣品濃度尤為重要，在此條件下選擇0.264 mg/mL的龍眼殼黃酮濃度較好。

2.1.3 龍眼殼黃酮樣品pH值對樹脂純化的影響

取5只50 mL的三角燒瓶，各加入1 g處理好的樹脂和濃度為0.264 mg/mL的龍眼殼黃酮樣品25 mL，把pH值分別調到2.00、3.00、4.03、5.08、6.00，震蕩12 h后，測得結果如表3。

表3 不同pH值條件下的吸附率Table 3The adsorption rate at different pH conditions

由表3可得，pH值在3時吸附率最高，在3以下時吸附率隨pH值升高而降低，說明pH值對吸附率的影響較為明顯，pH值為3時，最有利于樹脂對龍眼殼黃酮樣品的吸附。

2.2 高效液相色譜柱條件優(yōu)化及蘆丁標準曲線的制備

2.2.1 流動相體積分數(shù)的選擇

綜合考慮洗脫能力以及成本等因素，選擇甲醇作為流動相。依次用體積分數(shù)為25%、50%、75%和100%的甲醇溶液進行等度洗脫（控制流速為1 mL/min），分別收集各自的洗脫液，測出洗脫液中龍眼殼黃酮類物質的含量，繪制曲線，選擇最佳的洗脫液體積分數(shù)。試驗表明，當甲醇濃度為25%時，黃酮類物質的含量較高、當甲醇濃度為50%時，黃酮類物質的含量有點降低，當甲醇濃度為75%時，黃酮類物質的含量有點偏低，當甲醇濃度為100%時，黃酮類物質的含量最低。

甲醇的體積分數(shù)為25%時效果最好，甲醇體積分數(shù)過高時效果不太理想，這是因為色譜法是根據被分離物質與色譜柱之間的吸附強弱來選擇不同的流動相和相應的體積分數(shù)。在上述4中不同體積分數(shù)的甲醇流動相中，25%的甲醇溶液的極性最大，故其洗脫效果最好。

2.2.2 流動相流速的選擇

將龍眼殼黃酮樣品以不同流速進行色譜分析檢測，測定流出液中龍眼殼黃酮的含量。流動相流速的選擇見表5。

表5 流動相流速的選擇Table 5Selection of mobile phase flow rate

由表5可知，隨著流速加快，龍眼殼黃酮的含量越來越低，流動相流速為0.2、0.5 mL/min時含量較為接近，差異不是很大。流動相流速為1、1.5 mL/min時含量降低較明顯。顯然此流速不適宜，流動性流速以慢為好，但是過慢會延長周期，從而提高成本。綜合考慮，流動相流速應為0.5 mL/min適宜。最后選擇高效液相色譜柱條件為：C18柱，流動相：甲醇-水（25∶75，體積比），流速：0.5 mL/min，波長：254 nm，柱溫：25℃，進樣量：4 μL。在此色譜條件下，參照張海軍等的《高效液相色譜法（HPLC）測定大豆異黃酮含量的研究》中標準曲線的制備及線性關系的考查[9]。

2.3 蘆丁標準品線性關系的考察

在試驗過程中，我們對乙醇洗脫濃度、龍眼殼黃酮樣品上樣量、龍眼殼黃酮樣品的pH值、流動相體積分數(shù)、流動相pH值進行了優(yōu)化，分別得到了最佳的純化和分離條件。選擇純化過程中的最佳條件，得到5個龍眼殼黃酮樣品，然后再最佳的色譜條件下，分別對標準溶液、各濃度蘆丁標樣進行色譜分析。以峰面積為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，進而計算回歸方程為：Y=1 347.3X-27.63，R2=0.999 1。則由數(shù)據可以分析得出標準品具有良好線性關系。

2.4 HPLC檢測樣品與標準品

采用以上試驗優(yōu)化后最佳的工藝條件對樣品進行檢測，標準品、樣品的HPLC色譜圖見圖1～圖6。

由圖1～圖6和表6數(shù)據可見采用AB-8大孔徑樹脂柱層析法對龍眼殼黃酮采用最優(yōu)條件進行純化，以乙醇為洗脫劑，采用濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液各30 mL梯度洗脫，分段采集得5份純化樣品，采用HPLC法，對樣品進行檢測，并與蘆丁標準品進行比對，所得5份樣品中蘆丁含量分別為：9.02%、10.28%、23.24%、45.09%、63.95%呈梯度分布。

圖1 蘆丁標準品HPLC色譜圖Fig.1HPLC chromatogram of rutin standard

圖2 樣品1 HPLC色譜圖Fig.2HPLC chromatogram of sample 1

圖3 樣品2 HPLC色譜圖Fig.3HPLC chromatogram of sample 2

圖4 樣品3 HPLC色譜圖Fig.4HPLC chromatogram of sample 3

3 結論

采用AB-8大孔徑樹脂柱層析法，以乙醇為洗脫液可有效純化龍眼殼黃酮粗提物；龍眼殼黃酮中主要成分為蘆丁；乙醇洗脫液濃度越高則所得純化后樣品中龍眼殼黃酮純度越高，其中洗脫液為90%乙醇溶液，流動相甲醇的體積分數(shù)為25%流動相流速應為0.5 mL/min時，所得純化樣品中蘆丁純度最高達63.95%。

圖5 樣品4 HPLC色譜圖Fig.5HPLC chromatogram of sample 4

圖6 樣品5 HPLC色譜圖Fig.6HPLC chromatogram of sample 5

表6 各樣品的HPLC檢測指標Table 6HPLC test result of each sample

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[2]江蘇新醫(yī)學院．中藥大詞典(上)[M]．上海：上海人民出版社,1997

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[9]張海軍,蘇連泰.高效液相色譜法(HPLC)測定大豆異黃酮含量的研究[J].大豆科學,2011,30(4)：672-675

Study on Purification of Longan Shell Flavonoids

WANG Jun1，HAN Shu-qin1，*，LI Zhi-rui1，Lü Ping2
（1.Zhongshan Polytechnic，Zhongshan 528404，Guangdong，China；2.Tianjin Vocational Institute，Tianjin 300402，China）

ThelonganshellflavonoidswerepurifiedbyAB-8macroporousresincolumnchromatographymethod，thoseelutionconditions，suchasvolumeofsample，pHvalueandelutiondensitywereoptimized，andthebestpurification process conditions were the volume of sample，10 mL；the concentration of eluent，0.264 mg/mL；pH value，3；eluent，90%ethanol.Under these HPLC conditions[C18 column，mobile phase：methanol and water（25∶75，volume ratio），flow rate：0.5 mL/min，wavelength：254 nm，column temperature：25℃，sample quantity：4μL]，purification sample was tested and the result contrasted with rutin standard showed that the rutin concentration was up to 63.95%in sample under the optimal process condition and the column chromatography method.

longan shell；flavone；large aperture resin；purify

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.017

2017-01-04

中山市科技計劃項目（2014A2FC254）；天津市科技特派員項目（16JCTPJC47900）

王俊（1982—），女（漢），實驗師，碩士研究生，從事功能材料合成與檢測。

*通信作者：韓淑琴（1980—），女（漢），講師，主要研究方向：天然產物有效成分提取與應用。