生物酶法提取黃秋葵果實黃酮工藝優化研究

王維婷，曹宏杰，郭溆，程安瑋，劉超，孫金月，*

（1.山東省農業科學院農產品研究所，山東濟南250100；2.山東省農產品精深加工技術重點實驗室，山東濟南250100；3.青島農業大學食品科學與工程學院，山東青島266109）

生物酶法提取黃秋葵果實黃酮工藝優化研究

王維婷1，2，曹宏杰3，郭溆1，2，程安瑋1，2，劉超1，2，孫金月1，2，*

（1.山東省農業科學院農產品研究所，山東濟南250100；2.山東省農產品精深加工技術重點實驗室，山東濟南250100；3.青島農業大學食品科學與工程學院，山東青島266109）

為優化黃秋葵果實黃酮的提取工藝，以黃秋葵果實為原料，采用生物酶（纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶）法提取黃秋葵果實黃酮，探討酶添加量、酶解溫度、料水比、酶解時間、緩沖液pH值對黃酮得率的影響。在單因素試驗的基礎上，設計正交試驗對黃秋葵果實中黃酮的提取工藝條件進行優化；最優條件下，纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶提取黃秋葵果實黃酮最高含量分別為：70.385、64.522、62.167mg/g。

黃秋葵；黃酮；果膠酶；纖維素酶；木瓜蛋白酶

黃秋葵原產自非洲的埃塞俄比亞一帶，因為其果實脂肪含量低、熱量低、營養豐富[1-2]，在歐美地區早已將黃秋葵作為運動員的食用蔬菜及老年人的保健蔬菜品種之一，因其外形像羊角一樣故又稱為羊角豆。近年來，在日本、中國十分流行，黃秋葵所具有的抗疲勞、健胃助消化、提高免疫力等功效也逐漸被人們所認識[3-5]。我國自70世紀90年代從印度引入黃秋葵開始種植[3]，由于氣候土壤合適，在湖南、湖北、江蘇、山東等地廣泛種植，已成為我國出口新興保健蔬菜的重要品種之一。黃酮作為黃秋葵嫩果中重要的活性物質，具有抗氧化性、抗炎、抗衰老、抗癌等作用[6-8]，也漸漸地被深入研究，目前關于黃秋葵果實黃酮的研究比較少，具有很好的研究應用前景。

黃酮作為與秋葵功效有直接關系的一種活性物質，具有很好的藥用價值，而目前關于黃秋葵的活性物質的研究主要集中于不同活性成分的分析上，對于如何從黃秋葵果實中最大效率的提取黃酮的工藝研究還比較少。本研究通過優化黃秋葵果實中黃酮的提取技術，為分析其黃酮的含量、評價黃秋葵果實黃酮的營養品質提供技術支持，為黃秋葵深入的開發提供理論和數據參考，具有明顯的應用前景與科學意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃秋葵（取自山東省農業科學院農產品研究所章丘龍山試驗基地），品種為早生五角。將采摘下的黃秋葵果實清洗干凈切片，-25℃凍存。將冷凍的秋葵片在冷凍干燥機中冷凍干燥后，磨粉置于干燥皿中保存。

無水乙醇（分析純）：天津富宇化工；三水合檸檬酸三鈉、氫氧化鈉、鹽酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁（分析純）：西隴化工股份有限公司；纖維素酶（400 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、果膠酶（500 U/mg）：源葉生物公司。

XMTE-8112恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；6202小型高速粉碎機：臺灣興實利和公司；UV-1800紫外可見分光光度計：日本島津國際貿易有限公司；UPW-20N超純水器：北京市歷元電子儀器公司；LXJ-IIB離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.2 試驗方法

采用生物酶（果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶）法提取黃秋葵果實黃酮，探討酶添加量、提取溫度、料水比、酶解時間、緩沖液pH值對黃酮得率的影響。

取黃秋葵果實粉末1 g于試管中，加入一定量的生物酶（果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶）及緩沖溶液，在不同的溫度下恒溫水浴。一定時間后于100℃下滅酶處理，冷卻至室溫。加入與緩沖溶液等體積的80%的乙醇溶液在50℃下浸提120 min，將溶液倒入25 mL離心管中在4 000 r/min下離心10 min。取10 mL上清液于25 mL容量瓶中，加入0.7 mL的5%的亞硝酸鈉溶液，充分混勻后靜置6 min；加入0.7 mL的10%硝酸鋁溶液，混勻后靜置6 min；加入4%的氫氧化鈉溶液5 mL后，用80%的乙醇定容至刻度線，室溫下放置15 min。充分反應后倒入10 mL離心管中在3 500 r/min下離心5 min，取上清液在510 nm處比色測量吸光度。

標準曲線繪制及黃酮得率的計算采用李加興等的超聲輔助提取工藝[9]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 緩沖液pH值對黃酮提取的影響

根據不同酶的特點選定緩沖液pH值做單因素試驗，在其他因素不變的條件下考察該因素對黃秋葵果實中黃酮得率的影響。固定提取溫度為50℃，酶添加量3%，酶解時間90 min，料水比為1∶30（g/mL）。緩沖液pH值對酶提取黃秋葵黃酮得率影響見圖1。

圖1 緩沖液pH值對黃秋葵黃酮得率的影響曲線圖Fig.1The effect of buffer pH influence on okra flavonoids yield

由圖1可以看出，隨著pH值的增大，纖維素酶的黃酮提取效率先上升后降低，在pH 4.0時達到峰值32.739 mg/g，隨后下降；果膠酶的黃酮得率峰值出現在pH 3.5時，為31.645 mg/g，而木瓜蛋白酶的峰值為pH 5.0，黃酮得率為35.934 mg/g。酶在最適反應pH條件下能夠最大活力，使得黃秋葵果實中的黃酮加快溶出。

2.1.2 酶解時間對黃酮提取的影響

根據不同酶的特點進行酶解時間單因素試驗，考察該因素對黃秋葵果實中黃酮得率的影響。根據不同酶的特點選擇其最適pH值：纖維素酶4.0、果膠酶pH值為3.5、木瓜蛋白酶5.0；固定提取溫度為50℃，酶添加量3%，料水比為1∶30（g/mL）。緩沖液pH值對酶提取黃秋葵黃酮得率影響見圖2。

從圖2可以看出，隨著時間的延長，黃酮的得率也不斷的上升，酶活力得到充分的利用，酶解反應比較完全，果膠酶和蛋白酶在120 min時酶解效果最充分，提取黃酮得率分別為45.665、38.670 mg/g，纖維素酶在150 min時酶解效果最好，提取黃酮得率為43.082mg/g。果膠酶的提取效果最佳，其次為纖維素酶和蛋白酶。

圖2 酶解時間對黃秋葵黃酮得率的影響Fig.2The influence of extraction time of okra flavonoid yield

2.1.3 酶添加量對黃酮得率的影響

選定酶的添加量（1%～6%）做單因素試驗，在其他因素不變的條件下考察該因素對黃秋葵果實中黃酮得率的影響。根據不同酶的特點選擇其最適pH值：纖維素酶4.0、果膠酶3.5、木瓜蛋白酶5.0；提取時間纖維素酶150 min，果膠酶及木瓜蛋白酶120 min，固定提取溫度為50℃，料水比為1∶30（g/mL）。酶添加量對黃秋葵黃酮得率影響見圖3。

圖3 不同酶添加量對黃秋葵黃酮得率的影響Fig.3Effect of different enzyme addition amount on okra flavonoid yield

由圖3可以看出，纖維素酶、果膠酶及木瓜蛋白酶添加量在1%～4%范圍內所提取的黃酮得率是逐漸增加的，超過4%后反而降低。這是因為底物的限制，此時如果繼續加大酶量，底物濃度對酶不能飽和，使得酶作用受到抑制，從而導致黃酮的得率下降。選用高濃度的酶會造成資源的浪費，因此選擇4%的酶添加量比較適宜，纖維素酶的酶解效果要好于果膠酶及蛋白酶，在酶添加量為4%的條件下，纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶提取的黃酮得率分別為54.322、45.537、39.117 mg/g。

2.1.4 料水比對黃酮提取的影響

選定料水比進行單因素試驗，在其他因素不變的條件下考察該因素對黃秋葵果實中黃酮得率的影響。根據不同酶的特點選擇其最適pH值及酶解時間；固定提取溫度為50℃，酶添加量為4%。料水比對黃秋葵黃酮得率影響見圖4。

圖4 料水比對黃秋葵黃酮提取含量的影響Fig.4The influence of water ratio on okra flavonoid extract content

由圖4可以看出，隨著料水比增加，3種酶的黃酮提取得率先上升，纖維素酶對黃酮得率的影響在料水比1∶50（g/mL）時黃酮得率最高，蛋白酶及果膠酶的黃酮提取率在料水比1∶40（g/mL）時最高，隨后黃酮得率呈下降的趨勢。料水比過低的時候，溶劑用量少，原料浸潤不完全，影響黃酮的析出，隨著料水比過高時會導致其他組分與黃酮的同時析出，從而影響顯色反應及提取效率。在料水比試驗當中黃酮提取得率最高的酶仍為纖維素酶，黃酮得率達到57.949 mg/g，其次為木瓜蛋白酶53.077 mg/g，最后為果膠酶47.186 mg/g。

2.1.5 酶解溫度對黃酮提取的影響

選定酶解溫度進行單因素試驗，考察該因素對黃秋葵果實中黃酮得率的影響。根據不同酶的特點選擇其最適pH值及酶解時間，纖維素酶料水比為1∶50（g/mL），果膠酶及蛋白酶料水比為1∶40（g/mL），固定酶添加量為4%。酶解溫度對黃秋葵黃酮得率影響見圖5。

圖5 酶解溫度對黃秋葵黃酮得率的影響Fig.5The influence of extraction temperature on okra flavonoid yield

由圖5可以看出，30℃～60℃時隨著溫度的上升，黃酮溶出的越多，因為纖維素酶、果膠酶的最適溫度為60℃左右，提取黃酮得率分別為60.537、73.989 mg/g；蛋白酶的最適溫度在50℃左右，此時提取黃酮含量為60.792 mg/g。在最適溫度條件下，酶的活力最大，酶解反應加快，黃酮得率不斷上升；超過最適溫度后，酶活性減弱，酶的穩定性降低，并且溫度過高還會破壞已經被提取出來的黃酮物質。

2.2 正交試驗結果與分析

2.2.1 纖維素酶正交試驗

在單因素試驗的基礎上，確定了相應的四水平，進行響應面分析，確定黃秋葵黃酮的最優提取方法，結果如表1所示。

表1 纖維素酶正交試驗方案及試驗結果Table 1Cellulase orthogonal test scheme and test results

纖維素酶的酶添加量為4%、緩沖溶液pH值為4.0、提取溫度為60℃、料水比為1∶30（g/mL）、提取時間為150 min時提取量最大。影響條件：溫度＞酶解時間＞pH值＞料水比＞酶添加量。提取的黃酮得率達到71.265 mg/g，提取得率高于果膠酶及纖維素酶。

2.2.2 果膠酶正交試驗

在單因素試驗的基礎上，篩選出適當的因素及水平，進行響應面分析，確定黃秋葵黃酮的最優提取方法，結果如表2所示。

表2 果膠酶正交試驗方案及試驗結果Table 2Pectinase orthogonal test scheme and test results

續表2 果膠酶正交試驗方案及試驗結果Continue table 2Pectinase orthogonal test scheme and test results

由表2結果可以看出，在果膠酶添加量為2%，pH值為5，溫度為60℃，料水比為1∶50（g/mL），提取時間為90 min時，提取效果最佳。影響條件：溫度＞酶解時間＞酶添加量＞pH值＞料水比，提取的黃酮得率達到64.323 mg/g，提取效率略低于纖維素酶，但提取時間明顯縮短。

2.2.3 木瓜蛋白酶正交試驗

在單因素試驗的基礎上，篩選出適當的因素及水平，進行響應面分析，確定木瓜蛋白酶提取黃秋葵黃酮的最優條件，結果如表3所示。

表3 木瓜蛋白酶正交試驗方案及試驗結果Table 3Papain orthogonal test scheme and test results

續表3木瓜蛋白酶正交試驗方案及試驗結果Continue table 3Papain orthogonal test scheme and test results

木瓜蛋白酶的酶添加量為2%、緩沖溶液pH值為4、提取溫度為40℃、料水比為1∶40（g/mL）、提取時間為120 min時黃酮得率最高，提取的黃酮得率為63.411 mg/g。影響條件：提取溫度＞料水比＞酶添加量＞pH值＞酶解時間，其提取效率低于纖維素酶及果膠酶，但提取溫度較低，能耗較少。

2.3 驗證性試驗

為進一步考察上述優選工藝的穩定性，在2.2中3種酶最佳提取條件下，分別進行3次平行試驗，最終纖維素酶的最佳提取得率平均為70.385 mg/g，果膠酶平均為64.522，木瓜蛋白酶平均為62.167，驗證試驗結果均優于正交其他條件，證明上述參數組合為最佳提取條件。

3 結論

在單因素試驗結果的基礎上，采用正交試驗方法分別對黃秋葵果實總黃酮的提取工藝進行優化，獲得了纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶提取黃秋葵果實黃酮的最佳反應條件。纖維素酶提取黃秋葵果實黃酮的最佳條件為：酶添加量4%，提取緩沖液pH值為4，提取溫度60℃，料水比1∶30（g/mL），提取時間150 min，此時提取的黃酮得率平均值為70.385 mg/g；果膠酶提取時反應體系中果膠酶添加量2%，提取緩沖液pH值為4，提取溫度60℃，料水比1∶50（g/mL），提取90 min時提取的黃酮得率最高為64.522 mg/g；木瓜蛋白酶提取黃秋葵果實黃酮效率最高的反應體系條件為：酶添加量2%，提取緩沖液pH值為4，提取溫度40℃，料水比1∶40（g/mL），提取時間120 min，此時提取的黃酮得率平均值為62.167 mg/g。

試驗結果表明，溫度對黃秋葵果實黃酮的提取影響效果最大，因酶活力的高低與溫度有直接關系，其余因素因酶不同而具有不同的影響效果。

黃秋葵黃酮體外抗氧化活性試驗，證明了秋葵黃酮有較強的·OH、O2-·，DPPH自由基清除能力，表現出較好的體外抗氧化活性[9]，加之黃秋葵果實產量高，種植適應性廣，原料易獲取，因此黃秋葵黃酮的工業化應用具有一定的開發研究價值，本研究為該類工作的開展提供的工藝研究基礎。

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Optimization of Bio-enzyme Method for Flavones Extraction from Okra Fruit

WANG Wei-ting1，2，CAO Hong-jie3，GUO Xu1，2，CHENG An-wei1，2，LIU Chao1，2，SUN Jin-yue1，2，*
（1.Institute of Agro-Food Science&Technology，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250100，Shandong，China；2.Key Laboratory of Agro-Products Processing Technology of Shandong Province，Jinan 250100，Shandong，China；3.College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China）

In order to optimize the fruit extraction technology of falconoid，bio-enzyme method was applied for total flavones extraction from okra fruit.The impact of flavones of enzyme concentration，pH，temperature，mass ratio of material to water，time had been discussed.Basing on the single factor experiments，orthogonal design experiments had been used to optimized the extraction condition.However，the okra fruit highest flavonoid content could reached to 70.385，64.522，62.167 mg/g using the cellulase，pectinase，papain extraction under the optimal conditions.

okra；flavonoids；pectinase；cellulase；papain

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.027

2016-07-18

山東省農業科學院青年科研基金項目（2014QNM55）；山東省自主創新成果轉化專項（2014CGZH0712）

王維婷（1981—），女（漢），副研究員，博士，主要從事生物活性物質提取與功能鑒定研究。

*通信作者：孫金月（1967—），男，研究員，主要從事生物活性物質與功能食品研究。