肉及肉制品中牦牛源性成分的PCR鑒別

段慶梓，尚柯，張彪，張玉，王巍，梁恒興

（成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川成都610045）

肉及肉制品中牦牛源性成分的PCR鑒別

段慶梓，尚柯，張彪，張玉，王巍，梁恒興*

（成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川成都610045）

通過(guò)牦牛與其他常見(jiàn)物種的細(xì)胞色素b基因序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)牦牛的特異性引物，并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）體系中不同條件、參數(shù)的考察，建立肉及肉制品中牦牛源性檢測(cè)的PCR方法。該方法具有較好的專(zhuān)屬性，建立的PCR體系僅對(duì)牦牛源性有擴(kuò)增現(xiàn)象，而對(duì)其他物種無(wú)擴(kuò)增，且對(duì)牦牛源性的檢出限可達(dá)到1%。能夠滿(mǎn)足檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)或生產(chǎn)企業(yè)對(duì)肉及肉制品中牦牛源性的檢測(cè)需求。

肉制品；牦牛；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；分子鑒別

牦牛（Bog grunniens）是唯一能適應(yīng)青藏高原及周邊地區(qū)特殊生態(tài)環(huán)境且延續(xù)至今的牛種，主要分布于我國(guó)的青藏高原地區(qū)，為廣大藏區(qū)人民提供奶、肉、毛、役力、燃料等生產(chǎn)、生活必需品，具有不可替代性，也是該區(qū)域草地畜牧業(yè)和民族經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的資源依托[1]。

牦牛肉作為一種高品質(zhì)肉類(lèi)，氨基酸含量豐富、種類(lèi)齊全，營(yíng)養(yǎng)成分顯著高于其他牛種[2]。近年來(lái)，隨著旅游行業(yè)的快速發(fā)展，牦牛肉制品以其較好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的天然口感越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞，但其市場(chǎng)價(jià)格與其他牛肉存在較大差異。有報(bào)道曝光不良商家用黃牛肉、水牛肉甚至豬肉等肉質(zhì)來(lái)冒充牦牛肉的情況，以次充好，謀取暴利，欺騙消費(fèi)者。因此，牦牛肉制品中牦牛成分的鑒別已成為亟需解決的問(wèn)題。

目前有研究通過(guò)對(duì)線(xiàn)粒體12sRNA進(jìn)行基因擴(kuò)增、序列比對(duì)和限制性?xún)?nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài)性反應(yīng)來(lái)對(duì)黃牛、水牛、牦牛等物種進(jìn)行鑒別[3-4]，雖然這些方法能夠?qū)﹃笈Ｔ葱赃M(jìn)行鑒別，但其操作過(guò)程復(fù)雜、結(jié)果判定的專(zhuān)屬性不強(qiáng)，未能形成對(duì)牦牛源性快速、準(zhǔn)確的鑒別。動(dòng)物線(xiàn)粒體脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）作為高等動(dòng)物唯一的核外遺傳物質(zhì)，與核基因組相比具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速率快、多態(tài)性豐富、無(wú)重組和遵循母系遺傳等特點(diǎn)，是一個(gè)比較理想的用于檢測(cè)的靶基因，并且在動(dòng)物所有組織細(xì)胞中均含有大量線(xiàn)粒體，因此可以獲得大量的線(xiàn)粒體DNA[5-6]。早在20世紀(jì)90年代就有學(xué)者用細(xì)胞色素b（Cytochrome b，Cytb）基因作為分子標(biāo)記來(lái)進(jìn)行肉源性的鑒別，即使在各種條件下處理過(guò)的肉制品，也能通過(guò)Cytb基因的PCR擴(kuò)增和序列比對(duì)的方法來(lái)進(jìn)行鑒別[7-9]。

在本研究中，通過(guò)牦牛與其他常見(jiàn)物種Cytb基因的序列比對(duì)，設(shè)計(jì)牦牛特異性引物，并對(duì)PCR體系中不同條件、參數(shù)的考察，最終建立了牦牛源性檢測(cè)的PCR方法。目的在于突破現(xiàn)有牦牛源性檢測(cè)的局限性，在遺傳本質(zhì)上為牦牛源性提供一種快速、準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)的鑒別方法。

1 材料

1.1 樣品與對(duì)照

生鮮牦牛肉：四川阿壩州馬爾康市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；牦牛肉制品：西藏、青海、四川當(dāng)?shù)爻胸浖埽魂?yáng)性對(duì)照（生鮮牦牛肉）：四川省阿壩州馬爾康市場(chǎng)；陰性對(duì)照為常見(jiàn)的動(dòng)物肉樣（黃牛、水牛、豬、綿羊、兔、雞、鴨、馬、小鼠、貓、狐貍、貉）：中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；空白對(duì)照為滅菌的超純水。

1.2 試劑

動(dòng)物基因組提取試劑盒（GK0122）：上海捷瑞生物科技有限公司；2×PCR預(yù)混液（K20420）：北京Transgene公司；DNA Marker：北京天根生物科技有限公司；GoldView：北京百泰克公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

LS-P96GPCR儀：美國(guó)FisherScientific公司；5427R離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；PowerPac Basic電泳儀：美國(guó)BIO-RAD公司；GelDoc凝膠成像儀：美國(guó)UVP公司；ME2002E電子天平：瑞士特勒-托利多公司；P-330核酸蛋白儀：德國(guó)IMPLEN公司；DK-420水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GENIE 2渦旋儀：美國(guó)IKA公司。

2 方法

2.1 特異性引物的設(shè)計(jì)

研究選取線(xiàn)粒體DNA中的Cytb基因作為目標(biāo)檢測(cè)的靶基因，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找不同品種牦牛及常見(jiàn)動(dòng)物（黃牛、水牛、豬、綿羊、兔、雞、鴨、馬、小鼠、貓、狐貍、貉）的Cytb基因序列，并進(jìn)行物種間的序列比對(duì)，在牦牛與其他物種的DNA堿基差異區(qū)域設(shè)計(jì)牦牛特異性引物（見(jiàn)圖1），用于牦牛的特異性檢測(cè)；所設(shè)計(jì)引物由上海生工進(jìn)行合成，具體引物堿基序列見(jiàn)表1。

圖1 牦牛源性特異性引物位置Fig.1Specific primers for identification of yak

表1 牦牛源性鑒別引物序列Table 1Primer sequence for identification of yak

2.2 樣品前處理及DNA提取

對(duì)不同種類(lèi)的牦牛肉制品取樣前須去除附著的調(diào)料及油脂，選取8個(gè)不同的瘦肉部位進(jìn)行取樣，加入液氮，研磨成肉糜樣，備用。在前處理過(guò)程中須使用滅菌的器具進(jìn)行操作，避免各批次樣品之間的交叉污染。

稱(chēng)取前處理后的樣品30 mg～50 mg，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行DNA提取，最終溶于50 μL滅菌的超純水中，-20℃保存?zhèn)溆谩２?duì)提取的DNA進(jìn)行A260/A280值測(cè)定，測(cè)定的A260/A280比值在1.8～2.0之間，DNA濃度在100 ng/μL～150 ng/μL。

2.3 牦牛特異性引物退火溫度的考察

為確定牦牛特異性引物YAK-P和YAK-RP的最佳退火溫度，進(jìn)行了溫度梯度的篩選，分別設(shè)置退火溫度為：56、58、60、62、64℃。PCR擴(kuò)增均設(shè)置為30個(gè)循環(huán)反應(yīng)。

2.4 不同比例混合肉樣的PCR檢測(cè)

為確定牦牛源性鑒別PCR方法的靈敏度，研究設(shè)計(jì)了牦牛肉分別與豬肉、水牛肉和黃牛肉不同比例混合的肉樣進(jìn)行PCR檢測(cè)。即分別以豬肉、水牛肉和黃牛肉為基質(zhì)，相應(yīng)添加1%、5%、10%、25%、50%的牦牛肉進(jìn)行制樣，充分混合均勻后進(jìn)行DNA提取，以混合樣DNA為模板進(jìn)行牦牛鑒別引物的PCR擴(kuò)增。

2.5 牦牛源性PCR檢測(cè)體系的方法學(xué)驗(yàn)證

Cytb基因在牦牛種內(nèi)具有高保守的特點(diǎn)，該特異性檢測(cè)可以對(duì)牦牛種內(nèi)所有品系進(jìn)行鑒定。由于不同地區(qū)牦牛的基因組中存在多態(tài)性位點(diǎn)[10]，為避免牦牛多態(tài)性位點(diǎn)存在于特異性引物的3'端，造成引物無(wú)法有效擴(kuò)增的現(xiàn)象，利用牦牛特異性引物與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中提交的牦牛品種Cytb基因進(jìn)行比對(duì)（見(jiàn)圖2），結(jié)果顯示牦牛特異性引物（YAK-P，YAK-RP）的3'端均位于牦牛序列的保守區(qū)，理論上證明了所設(shè)計(jì)的牦牛鑒別特異性引物能夠?qū)λ嘘笈Ｆ贩N實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增。

圖2 牦牛特異性引物與不同品種牦牛Cytb序列比對(duì)Fig.2Specific primersof yak alignment with different strains of yak

本研究分別從西藏、青海、四川購(gòu)買(mǎi)牦牛肉制品共計(jì)9個(gè)批次，進(jìn)一步對(duì)所設(shè)計(jì)的牦牛特異性引物及PCR檢測(cè)體系進(jìn)行適應(yīng)性考察。

2.6 結(jié)果分析

對(duì)所有PCR結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，配制膠濃度為1.5%，并加入核酸染料GoldView。電泳條件為120 V恒壓電泳至凝膠中部，保存凝膠圖譜以進(jìn)行結(jié)果判定。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR反應(yīng)體系的建立

根據(jù)不同的退火溫度分別對(duì)牦牛特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同退火溫度的PCR反應(yīng)Fig.3PCR results of different annealing temperature

56℃～64℃均有牦牛源性的PCR擴(kuò)增，退火溫度為64℃時(shí)，擴(kuò)增條帶與其他溫度相比較弱，而56℃～ 62℃的擴(kuò)增條帶亮度較為一致，依據(jù)退火溫度越高，引物結(jié)合的特異性越好的原則，選擇62℃為最佳的退火溫度。

依據(jù)篩選的最佳退火溫度，設(shè)定PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min，30個(gè)循環(huán)（94℃30 s，62℃30 s，72℃30 s），72℃5 min。反應(yīng)體系的體積為25 μL：2×PCR混合液12.5 μL、正反向引物（20 μmol/L）各0.4 μL、模板DNA 1 μL，滅菌超純水補(bǔ)足25 μL。

3.2 牦牛源性試驗(yàn)對(duì)照的PCR結(jié)果

分別對(duì)牦牛陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 牦牛特異性引物對(duì)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照的PCR結(jié)果Fig.4PCR results of positive control，negative control and blank control

除牦牛能夠擴(kuò)增出301 bp的單一條帶，其他物種均無(wú)條帶擴(kuò)增，以此來(lái)實(shí)現(xiàn)牦牛與其他物種的鑒別。該結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的特異性引物及建立牦牛源性PCR檢測(cè)體系的能夠?qū)﹃笈Ｔ葱赃M(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，專(zhuān)屬性較好。

3.3 不同比例混合肉樣的PCR結(jié)果

不同比例混合肉樣的PCR結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同比例混合肉樣的PCR擴(kuò)增Fig.5PCR results of different proportions with yak，pig，cattle and buffalo

在豬肉、黃牛肉和水牛肉中添加1%的牦牛肉時(shí)即被檢出，PCR條帶較弱，但隨著牦牛肉比例的增加，PCR條帶的亮度也逐漸變量，與添加量的變化基本呈正相關(guān)。該結(jié)果表明，所建立的牦牛鑒別PCR體系所能檢出牦牛源性的檢出限為1%，反應(yīng)體系的靈敏度較高。

3.4 牦牛源性PCR檢測(cè)體系適應(yīng)性的考察

分別取從不同產(chǎn)區(qū)購(gòu)買(mǎi)的9批牦牛肉制品進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同產(chǎn)區(qū)樣品牦牛源性PCR結(jié)果Fig.6PCR results of yak samples from different regions

所購(gòu)買(mǎi)的9批牦牛肉制品均出現(xiàn)與牦牛陽(yáng)性對(duì)照一致的條帶；表明所有樣品都含有牦牛源性成分。該結(jié)果表明所建立的牦牛特異性PCR鑒別體系對(duì)市場(chǎng)售賣(mài)的牦牛肉制品有較好的方法適應(yīng)性。

4 結(jié)論

本研究依據(jù)牦牛與其他常見(jiàn)物種Cytb基因的堿基差異，設(shè)計(jì)了特異性引物，并建立了牦牛源性檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系，該體系能夠?qū)﹃笈U(kuò)增大小為301 bp的條帶，而對(duì)其他物種無(wú)擴(kuò)增，因此得以鑒別。通過(guò)進(jìn)行牦牛與豬肉、水牛和黃牛不同比例混合肉樣的方法研究，該體系對(duì)牦牛源性的檢測(cè)低限可達(dá)到1%。同時(shí)，建立的牦牛特異性PCR鑒別體系對(duì)市售的牦牛肉制品有較好的方法適應(yīng)性。

綜上所述，本研究建立的肉及肉制品中牦牛源性成分檢測(cè)的PCR體系，能夠完成對(duì)不同牦牛肉制品的特異性檢測(cè)，且方法準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便，適合作為檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)或生產(chǎn)企業(yè)用于牦牛源性成分的檢測(cè)方法。

[1]中國(guó)畜禽遺傳資源狀況編委會(huì).中國(guó)畜禽遺傳資源狀況[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2004：18

[2]邱翔,張磊,文勇立,等.四川牦牛、黃牛主要品種肉的營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].食品科學(xué),2010,31(15)：112-116

[3]P S Girish,A S R Anjaneyulu,KN Viswas,et al.Sequence analysis of mitochondrial 12S rRNA gene can identify meat species[J].Meat Science,2004,66(3)：551-556

[4]陳冬,柏凡,周明亮,等.基于線(xiàn)粒體12S rRNA基因鑒別混合牛肉及制品的牛種來(lái)源[J].遺傳,2008,30(8)：1008-1014

[5]Bruford M W,Bradley D G,Luikart G.DNA markers reveal the complexity of liverstockdomestication[J].Nature Reviews Genetics, 2003,4(11)：900-910

[6]Momcilovic D,Rasooly A.Detection and analysis of animal materials in food and feed[J].Journal of Food Protection,2000,63(11)：1602-1609

[7]Chikuni K,Ozutsume K,HoishiKawa T,et al.Species identification of cooked meats by DNA hybridization assay[J].Meat Science,1990, 27(2)：119-128

[8]Chikuni K,Tabata T,Saito M,et al.Sequencing of mitochondrial cytochrome b genes for the identification of meat species[J].Animal Science and Technology,1994,65(6)：571-579

[9]M Burgener,P Hübner.Mitochondrial DNA enrichment for species identification and evolutionary analysis[J].European Food Research and Technology,1998,207(4)：261-263

[10]鐘金城,趙素君,陳智華.牦牛品種的遺傳多樣性及其分類(lèi)研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(2)：389-397

PCR Identification of Yak in Meat and Meat Products

DUAN Qing-zi，SHANG Ke，ZHANG Biao，ZHANG Yu，WANG Wei，LIANG Heng-xing*
（Chengdu Institute of Food and Drug Control，Chengdu 610045，Sichuan，China）

The specific primer of yak was designed by cytochrome b gene alignment between yak and other common species，which was used to establish the PCR detection of yak in meat products by Investigation of different conditions and parameters.The established PCR system had better specificity，which could only have amplification of yak，and not amplification of other species.The detection limit of yak could reach to 1%.The yak PCR system established could meet the demand of institutions or production enterprises to detect the source of yak in meat and meat products.

meat product；yak；polymerase chain reaction；molecular identification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.035

2017-02-17

成都市科技惠民應(yīng)用示范項(xiàng)目（2015-HM02-000990SF）

段慶梓（1984—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：食品藥品的分子鑒別。

*通信作者：梁恒興（1978—），男（漢），副研究員，研究方向：食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)。