高效液相色譜法檢測(cè)運(yùn)動(dòng)食品中的納他霉素

王亞君

（河南財(cái)政金融學(xué)院，河南鄭州450046）

高效液相色譜法檢測(cè)運(yùn)動(dòng)食品中的納他霉素

王亞君

（河南財(cái)政金融學(xué)院，河南鄭州450046）

建立一種快速、有效的高效液相色譜法測(cè)定運(yùn)動(dòng)食品中納他霉素殘留的方法。樣品經(jīng)甲醇提取后，采用HLB固相萃取小柱進(jìn)行凈化和富集。采用Waters RP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離，以甲醇∶水∶乙酸（體積比）= 60∶35∶5作為流動(dòng)相，用PDA檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法峰面積定量。結(jié)果表明，納他霉素標(biāo)準(zhǔn)在0.50μg/mL～10.00μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2為0.9999，檢出限為10.0μg/kg，定量限為30.0μg/kg，加標(biāo)回收率達(dá)到84.6%～90.5%。該方法具有前處理簡(jiǎn)單、凈化效果好、靈敏度高和檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)，適用于運(yùn)動(dòng)食品中納他霉素殘留的分離和定量檢測(cè)。

固相萃取；高效液相色譜；納他霉素

納他霉素（Natamycin）是一種由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的天然抗真菌化合物，屬于多烯大環(huán)內(nèi)酯類，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。納他霉素既可以廣泛有效的抑制各種霉菌、酵母菌的生長(zhǎng)，又能抑制真菌毒素的產(chǎn)生，可廣泛用于食品防腐保鮮以及抗真菌治療。運(yùn)動(dòng)食品又稱運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品，是與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的一類功能食品。此類食品定義為：能夠?yàn)檫\(yùn)動(dòng)者提供特殊營(yíng)養(yǎng)需求，調(diào)整代謝狀態(tài)，并有助于提高體能和體質(zhì)的食品。在各種運(yùn)動(dòng)食品中由于營(yíng)養(yǎng)豐富，有的含糖量、有機(jī)酸的含量較高，很適合酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，引起食品的腐敗變質(zhì)，使用納他霉素可以增加運(yùn)動(dòng)食品的貯存穩(wěn)定性。1996年，中國(guó)食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)技術(shù)委員會(huì)正式批準(zhǔn)納他霉素可作為食品防腐劑。FAO/WHO聯(lián)合食品添加劑專家委員會(huì)規(guī)定了人體可無(wú)條件接受每天攝入每公斤體重0.3 mg的納他霉素。我國(guó)國(guó)標(biāo)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[1]規(guī)定了納他霉素的在各類食品中最大使用量和殘留量。

圖1 納他霉素的結(jié)構(gòu)圖Fig.1Structure of natamycin

目前測(cè)定食品中的納他霉素方法主要有滴定法[2]、薄層分析法[2]、微生物法[3]、分光光度計(jì)法[4-5]、高效液相色譜法[6-10]以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]等。滴定法和分光光度計(jì)法較為簡(jiǎn)單，但是不能排除實(shí)際樣品中基質(zhì)干擾的影響，難以精確定量；薄層分析法主要用于定性分析，難以精確定量；微生物法適用于溶液、物質(zhì)浸出物或生物材料中納他霉素的測(cè)定，但其檢測(cè)周期長(zhǎng)，且選擇性較差，使其應(yīng)用受到了限制；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)精度高，但由于儀器價(jià)格昂貴難以普及，液相色譜法是目前食品中納他霉素殘留檢測(cè)中使用最多的方法，也能夠基本滿足檢測(cè)要求。本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取-高效液相色譜法（PDA）測(cè)定運(yùn)動(dòng)食品中的納他霉素，不僅可以滿足一般食品中納他霉素含量的檢測(cè)要求，而且可以針對(duì)食品中微量的納他霉素起到一個(gè)富集凈化的作用，從而達(dá)到檢測(cè)的目的，這一點(diǎn)非常適合運(yùn)動(dòng)食品這一類要求比較特殊的食品。本試驗(yàn)對(duì)運(yùn)動(dòng)食品的樣品前提取條件、固相萃取條件、儀器條件進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)驗(yàn)證本試驗(yàn)方法靈敏度高，準(zhǔn)確性好，是一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

2695型高效液相色譜系統(tǒng)、2998型PDA檢測(cè)器：Waters；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：IKA。

納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；甲醇、乙腈為色譜純。

HLB固相萃取小柱：規(guī)格3cc，250 mg。

1.2 樣品來(lái)源

樣品均為市場(chǎng)上銷售的各類運(yùn)動(dòng)食品。

1.3 色譜條件

色譜柱：Waters RP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

柱溫：30℃；

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 流動(dòng)相體系的選擇

固定流動(dòng)相流速1.0 mL/min，配制不同體系的流動(dòng)相，流動(dòng)相Ⅰ為甲醇∶水∶乙酸（體積比）=60∶35∶5；流動(dòng)相Ⅱ?yàn)榧状肌盟w積比）=60∶40；流動(dòng)相Ⅲ為甲醇∶乙酸銨溶液（體積比）=60∶40，考察了流動(dòng)相對(duì)納他霉素色譜行為的影響。

1.4.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本試驗(yàn)采用PDA檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（掃描范圍200 nm～400 nm），根據(jù)納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值，選擇比較合適的檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取相應(yīng)質(zhì)量的納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、10.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行儀器分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

運(yùn)動(dòng)食品中除了蛋白質(zhì)、脂肪、糖分等固有的食品基質(zhì)外，還含有很多的人為添加的營(yíng)養(yǎng)元素，成分復(fù)雜，對(duì)前處理要求高，所以本試驗(yàn)采用固相萃取技術(shù)，使用固相萃取小柱對(duì)納他霉素殘留起到一個(gè)凈化和富集的作用，并且對(duì)樣品的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，綜合選出一個(gè)優(yōu)化的前處理方法。

1.4.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)及樣品測(cè)定

以市售未添加納他霉素的運(yùn)動(dòng)食品為空白基質(zhì)，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件操作，過(guò)固相萃取柱，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相體系的選擇

參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)[6-11]，發(fā)現(xiàn)不同標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)檢測(cè)納他霉素殘留的流動(dòng)相體系不同，主要分為3大類流動(dòng)相體系：甲醇-水-乙酸溶液體系、甲醇/水體系和甲醇/乙酸銨溶液體系。所以為了了解這些流動(dòng)相對(duì)納他霉素色譜行為的影響，固定流動(dòng)相洗脫速度，配制不同體系的流動(dòng)相[Ⅰ：甲醇∶水∶乙酸（體積比）=60∶35∶5；流動(dòng)相Ⅱ：甲醇∶水（體積比）=60∶40；流動(dòng)相Ⅲ：甲醇∶乙酸銨溶液（體積比）=60∶40]，考察了流動(dòng)相對(duì)納他霉素色譜行為的影響。

結(jié)果表明：在3種流動(dòng)相體系中，均對(duì)納他霉素的色譜保留行為有不同程度的影響，其中流動(dòng)相[Ⅰ：甲醇∶水∶乙酸（體積比）=60∶35∶5]的分離度最好，如圖2所示，在RP C18柱上可得到良好的基線分離，其峰型良好，出峰時(shí)間合適。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本試驗(yàn)采用PDA檢測(cè)器對(duì)納他霉素進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（掃描范圍200 nm～400 nm）見(jiàn)圖3。

如圖3所示，納他霉素在302 nm和318 nm附近各存在一個(gè)吸收峰。納他霉素標(biāo)液在上述兩個(gè)特征波長(zhǎng)條件下的色譜圖對(duì)比顯示，302 m波長(zhǎng)條件下檢測(cè)的響應(yīng)值更高一點(diǎn)，峰形較好且峰形相近，所以選擇302 nm作為納他霉素的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 納他霉素的色譜圖Fig.2The chromatogram of natamycin

圖3 納他霉素的全波長(zhǎng)掃描圖Fig.3Full wavelength scanning chart of natamycin

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為了驗(yàn)證納他霉素在流動(dòng)相Ⅰ[甲醇∶水∶乙酸（體積比）=60∶35∶5]體系中的線性關(guān)系，配制了濃度為0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、10.00 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。試驗(yàn)結(jié)果表明，納他霉素在0.50 μg/mL～10.00 μg/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.99）；采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)色譜峰的信噪比（S/N）大于3倍確定檢出限（LOD），S/N大于10倍確定定量限（LOQ），得到納他霉素組分的LOD為10.0 μg/kg，LOQ為30.0 μg/kg，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 納他霉素的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of natamycin

2.4 提取溶劑的選擇

根據(jù)納他霉素的化學(xué)特性，其在水中的溶解度很低（約40 mg/L），在甲醇中的溶解度較高（1 200 mg/L）。參考GB/T 21915-2008《食品中納他霉素的測(cè)定液相色譜法》中方法，用甲醇-水溶液（30∶10，體積比）提取，但是在實(shí)際操作時(shí)，容易發(fā)生乳化現(xiàn)象，離心后提取溶液仍然不分層。因此試驗(yàn)以甲醇為提取劑，由于蛋白質(zhì)在甲醇中會(huì)變性而沉淀，脂肪在冷凍條件下會(huì)析出，再進(jìn)行冷凍離心，能較好地提取納他霉素，去除干擾組分的影響。

2.5 固相萃取淋洗液、洗脫液的條件優(yōu)化

固相萃取法集樣品提取、濃縮、凈化于一體，簡(jiǎn)化了操作步驟，減少了溶劑用量，提高了樣品前處理效率而受到重視。本試驗(yàn)中利用固相萃取柱主要進(jìn)行淋洗和洗脫兩步驟，淋洗液的主要作用就是將吸附在固相萃取HLB小柱上樣品雜質(zhì)給洗掉，一般有用甲醇-水、氨化甲醇、氨水溶液、水這4種淋洗方式，分別對(duì)這4種的淋洗效果進(jìn)行比較；洗脫液常用的有酸化甲醇和甲醇兩種洗脫溶劑，結(jié)果以納他霉素的回收率為比較依據(jù)。

結(jié)果顯示；氨水溶液作為淋洗液效果最好；酸化甲醇的洗脫效果要優(yōu)于甲醇，凈化后雜質(zhì)干擾較少，顏色比較淺，回收率能滿足分析測(cè)定的需求。

2.6 加標(biāo)回收與相對(duì)偏差

在以上試驗(yàn)的優(yōu)化條件下，利用空白基質(zhì)的運(yùn)動(dòng)食品樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，在分別添加2、4、8μg/mL 3個(gè)梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，每個(gè)濃度平行測(cè)定5次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，納他霉素的加標(biāo)回收率為84.6%～90.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.6%～2.0%，表明本試驗(yàn)所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。

表2 方法的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 2Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本文所建立的方法，對(duì)市售不同類型運(yùn)動(dòng)食品共40個(gè)批次進(jìn)行測(cè)定，共發(fā)現(xiàn)2個(gè)批次樣品含有納他霉素。如圖4所示，是一款運(yùn)動(dòng)食品中納他霉素的色譜圖。

圖4 樣品中納他霉素的色譜圖Fig.4The chromatogram of natamycin in the sample

3 結(jié)論

本文建立了一種固相萃取-高效液相色譜檢測(cè)運(yùn)動(dòng)食品中納他霉素殘留的分析方法。結(jié)果表明，在流動(dòng)相甲醇∶水∶乙酸（體積比）=60∶35∶5體系中，納他霉素能得到良好的基線分離，其峰型良好，出峰時(shí)間合適。在302 nm的檢測(cè)波長(zhǎng)下，樣品經(jīng)過(guò)甲醇提取后，再處理采用HLB固相萃取柱法可有效去除樣品中的復(fù)雜基質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的凈化與富集，能準(zhǔn)確快速有效地檢測(cè)運(yùn)動(dòng)食品中的納他霉素的殘留。

[1]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)．GB 2760-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S]．北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2014

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[6]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)．GB/T 21915-2008食品中納他霉素的測(cè)定液相色譜法[S]．北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008

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Determination of Natamycin in Sports Food by HPLC

WANG Ya-jun
（Henan Institute of Finance and Banking，Zhengzhou 450046，Henan，China）

A rapid and effective method was established for the determination of natamycin in sports food by HPLC.After the sample was extracted by methanol，it was concentrated and purified by HLB solid phase extraction column.The separation of target compound was performed on a Waters RP C18 chromatographic column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using methanol∶water∶acetic acid（60∶35∶5）as mobile phase，with PDA detector and external standard method peak area quantification.The linear range of natamycin was in the range of 0.50 μg/mL-10.00 μg/mL with a correlation coefficient of 0.999 9.The detection limit was 10 μg/kg and the quantitative limit was 30.0 μg/kg.The recovery rate was 84.6%-90.5%.The method has the advantages of simple pretreatment，good purifying effect，high sensitivity and fast detection rate.It is suitable for the separation and quantitative detection of natamycin in sports food.

solid phase extration（SPE）；high performance liquid chromatography（HPLC）；natamycin

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.037

2016-09-01

王亞君（1981—），女（漢），講師，碩士，研究方向：體育教育訓(xùn)練學(xué)。