黑皮雞樅菌固體培養基的優化

徐兵，張玉琴，冀宏

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟215500）

黑皮雞樅菌固體培養基的優化

徐兵，張玉琴，冀宏*

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟215500）

以黑皮雞樅菌菌絲日生長速率為指標，首先通過單因素試驗確定最佳的碳源、最佳碳源的最優量、最佳氮源、最佳氮源的最優量，然后經過響應面試驗的優化，得出最佳固體培養基配方：瓊脂20 g/L，果糖23 g/L，胰蛋白胨3 g/L，VB12mg/L，自然pH的條件下，通過驗證培養后，黑皮雞樅菌絲生長速率達到0.9cm/d。

黑皮雞樅菌；固體培養基；單因素；響應面法

黑皮雞樅菌（Termitomyces albuminosus）是屬擔子亞門菌，層菌綱，傘菌目，口蘑科[1-4]。其肉質鮮嫩，口感獨特，作為食品藥品皆可，備受人們青睞。黑皮雞樅菌是相關科研人員經過數年的潛心研究，在2006年選育出能實現人工栽培的珍稀食用菌，其中胡尚勤[5]、曾先福[6]等對雞樅菌的生長條件有一定的研究。雖然對于黑皮雞樅菌人工栽培技術有小規模的成果[7]，但對于黑皮雞樅菌固體培養基優化還鮮見報道，所以本試驗對黑皮雞樅固體培養基進行優化，試驗數據為生產提供了一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料和設備

黑皮雞樅：常熟理工學院食用菌發酵工程技術研究中心種植。

303A-3S型電熱恒溫干燥培養箱：浦東榮豐科學儀器廠；GZX-GF101-AO-S型電熱鼓風干燥箱：南京百思威科技有限公司；LDZX-75KBS（內循環）型立式壓力蒸汽滅菌器、M124A型電子天平：南京菲奇工貿有限公司；SW-CJ-2F型潔凈工作臺：蘇州凈化公司；ZQWY-200G型震蕩培養箱：上海知楚儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養基配方

母種培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，瓊脂20 g，pH自然。

基本培養基：葡萄糖20 g，酵母粉2 g，水1 000 mL，0.003 g，瓊脂20 g，pH自然。

1.2.2 固體培養

先對黑皮雞樅進行組織分離，做成母種，再將母種接種到基本培養基，在恒溫恒濕培養箱中培養，用卡尺測量菌落直徑，單位為mm。分別從每個配方中選擇長勢較好的培養皿，每個菌落用十字交叉法垂直測量直徑各1次，取其平均值。純生長量=菌落平均直徑-原培養基直徑，所以，黑皮雞樅菌菌絲日生長速率=純生長量/天數[8-11]。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 碳源的影響

以菌絲的日生長速率為指標，研究配方中不同碳源對黑皮雞樅菌菌絲生長速率的影響。碳源設為：葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉[12]。碳源的含量為20 g/L，酵母粉的含量為3 g/L，VB1的含量為3 mg/L，瓊脂20 g，1 000 mL水。

1.2.3.2 碳源含量的影響

以菌絲的日生長速率為指標，研究配方中碳源的不同含量對黑皮雞樅菌菌絲生長速率的影響。碳源的含量設為：10、15、20、25、30 g/L。酵母粉的含量為3 g/L，VB1的含量為3 mg/L，瓊脂20 g，1 000 mL水。

1.2.3.3 氮源的影響

以菌絲的日生長速率為指標，研究配方中不同氮源對黑皮雞樅菌菌絲生長速率的影響。氮源設為：蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、玉米粉、豆粕粉[13]。碳源的含量為20 g/L，氮源的含量為3 g/L，VB1的含量為3 mg/L，瓊脂20 g，1 000 mL水。

1.2.3.4 氮源含量的影響

以菌絲的日生長速率為指標，研究配方中氮源的不同含量對黑皮雞樅菌菌絲生長速率的影響。氮源的含量設為：1、2、3、4、5 g/L。碳源的含量為20 g/L，VB1的含量為3 mg/L，瓊脂20 g，1 000 mL水。

1.2.4 響應面試驗設計

碳源、氮源是影響黑皮雞樅固體培養的關鍵因素，微量元素對于菌絲體生長也是有一定幫助的，雖然微量，但是可以促進菌絲體生長。所以，本試驗將添加VB1的含量作為響應面研究的一個因素探討黑皮雞樅菌的最適固體培養基，采用Box-Behnken模型進行設計，采用Design Expert 8.05 b軟件進行數據處理。編碼與因子的實際濃度的對應關系見表1。

表1 編碼與因子的實際濃度的對應關系Table 1The corresponding relation between encode and factor practical concentration

2 結果與分析

2.1 固體培養條件優化單因素試驗

2.1.1 碳源的影響

不同碳源的黑皮雞樅菌菌絲日生長速率見圖1。

圖1 不同碳源的黑皮雞樅菌菌絲日生長速率Fig.1Mycelium growth rate of Termitomyces albuminosus from different glucose

由圖1可知，當固體培養基碳源是果糖的時候，黑皮雞樅菌絲日生長速率最大，是0.91 cm/d，其次是葡萄糖和蔗糖。因此，選擇果糖作為最佳碳源。

2.1.2 碳源含量的影響

果糖不同含量的黑皮雞樅菌菌絲日生長速率見圖2。

圖2 果糖不同含量的黑皮雞樅菌菌絲日生長速率Fig.2Mycelium growth rate of Termitomyces albuminosus from different amount of fructose

由圖2可知，黑皮雞樅菌絲日生長速率隨果糖的增加而升高，但當果糖含量達30 g/L后，黑皮雞樅菌絲日生長速率急速下降，因此，優選出3個果糖最佳含量：25、20、15 g/L。

2.1.3 氮源的影響

不同氮源的黑皮雞樅菌菌絲日生長速率見圖3。

由圖3可知，氮源的選擇對黑皮雞樅菌菌絲生長速率也有一定的影響。氮源為胰蛋白胨的培養基培養下的黑皮雞樅菌菌絲生長最快，是0.739 cm/d，最慢的是玉米粉為氮源的培養基，生長速率是0.421 cm/d，所以優選出最佳氮源為胰蛋白胨。

圖3 不同氮源的黑皮雞樅菌菌絲日生長速率Fig.3Mycelium growth rate of Termitomyces albuminosus from different nitrogen

2.1.4 氮源含量的影響

氮源的不同量黑皮雞樅菌菌絲日生長速率見圖4。

圖4 氮源的不同量黑皮雞樅菌菌絲日生長速率Fig.4Mycelium growth rate of Termitomyces albuminosus from different amount of nitrogen

由圖4可知，當胰蛋白胨含量為4 g/L的時候，黑皮雞樅菌日生長速率最大，其次是2 g/L和3g/L，所以優選出3個氮源含量為：2、3、4 g/L。

2.2 響應面試驗設計

按照Design Expert 8.05 b軟件中的Box-Behnken Design方法，經擬合后得到的回歸方程為：菌絲日生長速率=0.90+0.11A+0.013B+0.016C+3.750×10-3AB+ 0.016AC+2.000×10-3BC－0.10A2-0.093B2－0.14C2。Box-Behnken試驗設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2Design and results of Box-Behnken design

續表2Box-Behnken試驗設計及結果Continue table 2Design and results of Box-Behnken design

在本試驗中，模型顯著性檢驗P<0.0001，表明該模型具有統計學意義。R2=0.987 4，說明該模型可以被運用，能夠在試驗預測的實際范圍內。響應面試驗方差分析見表3。

表3 響應面試驗方差分析Table 3The variance analysis result of response test

由表3可知其自變量一次項A，二次項A2、B2、C2顯著（P<0.05），而自變量一次項B、C，二次項AB、AC、BC不顯著。進一步分析就是碳源-果糖的含量對黑皮雞樅菌菌絲生長速率表現顯著，而氮源-胰蛋白胨的含量和生長因子VB1的含量對黑皮雞樅菌菌絲生長速率作用不顯著。

果糖含量、胰蛋白胨含量對菌絲生長速率影響的響應面-3D圖見圖5，果糖含量、胰蛋白胨含量對菌絲生長速率影響的響應面-等高線圖見圖6，果糖含量、VB1的含量對菌絲生長速率影響的響應面-3D圖見圖7，果糖含量、VB1的含量對菌絲生長速率影響的響應面-等高線圖見圖8，胰蛋白胨含量、VB1含量對菌絲生長速率影響的響應面-3D圖見圖9，胰蛋白胨含量、VB1含量對菌絲生長速率影響的響應面-等高線圖見圖10。

圖5 果糖含量、胰蛋白胨含量對菌絲生長速率影響的響應面-3D圖Fig.5Response surface of the content of fructose and tryptone to the growth rate of mycelium-3D

圖6 果糖含量、胰蛋白胨含量對菌絲生長速率影響的響應面-等高線圖Fig.6Response surface of the content of fructose and tryptone to the growth rate of mycelium-contour

圖7 果糖含量、VB1的含量對菌絲生長速率影響的響應面-3D圖Fig.7Response surface of the content of fructose and VB1to the growth rate of mycelium-3D

圖8 果糖含量、VB1的含量對菌絲生長速率影響的響應面-等高線圖Fig.8Response surface of the content of fructose and VB1to the growth rate of mycelium-contour

圖9 胰蛋白胨含量、VB1含量對菌絲生長速率影響的響應面-3D圖Fig.9Response surface of the content of tryptone and VB1to the growth rate of mycelium-3D

圖10 胰蛋白胨含量、VB1含量對菌絲生長速率影響的響應面-等高線圖Fig.10Response surface of the content of tryptone and VB1to the growth rate of mycelium-contour

最終響應面設計試驗得到最佳固體培養基配方為：果糖22.71 g/L，胰蛋白胨3.08 g/L，VB12.09 mg/L，瓊脂20 g，1 000 mL的水，自然pH的條件下，菌絲日生長速率可達到0.93 cm/d。根據實際試驗情況將最優配方改良為：果糖23 g/L，胰蛋白胨3 g/L，ffffdf2 mg/L，瓊脂20 g，1 000 mL的水，自然pH的條件下，最后用此條件在培養箱中培養后，經測量得黑皮雞樅菌絲生在速率達到0.9 cm/d，與理論值相差不大，說明理論值具有一定可信度和可行性。

3 結論

本文通過單因素試驗和響應面設計試驗結果分析，碳源-果糖含量的選擇對黑皮雞樅菌菌絲生長有很大的影響，而氮源-胰蛋白胨的含量和VB1的含量對其沒有多大影響，可能是碳源在培養基中占很大的成分，氮源和生長因子所占比例較小，所以影響不大。所以，當固體培養基成分是瓊脂20 g，果糖23 g/L，胰蛋白胨3 g/L，2 mg/L，1 000 mL的水，自然pH的條件下，是最適合黑皮雞樅菌菌絲生長的。

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The Optimization of Solid Medium of the Termitomyces albuminosus

XU Bing，ZHANG Yu-qin，JI Hong*
（College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

The Termitomyces albuminosus mycelia growth rate was used as evaluation index，and the single factor test was used to optimize the carbon source，the concentration of carbon source，the nitrogen source and the amount of nitrogen source.Then the optimal solid medium was obtained by response surface methodology.The optimized solid culture medium component were agar 20 g/L，fructose 23 g/L，tryptone 3 g/L，VB12 mg/L，the natural pH value.The Termitomyces albuminosus mycelia growth rate reached up to 0.9 cm/d under the original fermentation conditions.

Termitomyces albuminosus；solidmedium；single factor；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.040

2016-07-20

常熟理工學院青年基金項目（QZ1504）；蘇州市項目（SNG201615）

徐兵（1982—），男（漢），實驗師，學士，研究方向：食用菌學。

*通信作者：冀宏（1969—），男（漢），教授，博士，研究方向：食、藥用菌。