15種維藥醫院制劑微生物限度檢查方法驗證

郝 娟 常 婧 王 毅

(新疆喀什地區食品藥品檢驗所，新疆 喀什 844000)

15種維藥醫院制劑微生物限度檢查方法驗證

郝 娟 常 婧 王 毅

(新疆喀什地區食品藥品檢驗所，新疆 喀什 844000)

目的：建立15種維藥醫院制劑的微生物限度檢查方法。方法:按《中國藥典》2010年版附錄微生物限度檢查法中細菌、霉菌及酵母菌計數方法和控制菌檢查法進行驗證。結果:供試品5種試驗菌回收率菌均高于70%，控制菌均能正常檢出。結論:維藥醫院制劑必須進行微生物限度檢查方法驗證，才能保證檢驗結果的正確性。

維藥醫院制劑；微生物限度；方法學驗證；回收率

新疆維藥居多，主要以醫院制劑的形式發展。目前醫院制劑普遍存在的質量標準檢測方法落后、質量標準缺項嚴重的問題[1]。藥品微生物檢驗主要是根據藥品質量標準所規定的相關指標對藥品在研制、生產、保存等過程中是否受到微生物污染來進行藥品質量以及安全性的綜合評定。[2]按《中國藥典》2010年版規定[3]，藥品進行微生物限度檢查時必須對方法學進行驗證，本文參考相關文獻[4-7]，根據制劑中成分的抑菌作用強度不同，采用了常規法、培養基稀釋法、薄膜過濾法制備供試品溶液，建立了15種醫院制劑相應的微生物限度檢測方法，經方法驗證試驗證實該方法簡便易行，消除抑菌作用有效。

1 儀器與材料

1.1 儀器:高壓蒸汽滅菌器，LDZH-150KBS，上海申安醫療器械廠；超凈工作臺，SW-CJ-2D,蘇州凈化設備有限公司；生物安全柜，BH3-1300，蘇州安泰空氣技術有限公司；HTY-III型集菌儀,杭州泰林醫療器械廠;一次性薄膜過濾器(規格FC502;批號20150814),杭州泰林生物技術設備有限公司。

1.2 樣品:復方比黑馬爾江膠囊(批號：20141201，20141202)；艾合米爾散(批號：20150101，20150102)；黑種草子油(批號：20141201，20141202)；依提爾菲力開西尼孜丸(批號：20150201，20150202)；小茴香露劑(批號：20141201，20141202)均有新疆喀什地區葉城縣維吾爾醫醫院提供.加瓦日西庫木尼蜜膏(批號：20141101，20141201)；驅白馬日白熱斯丸(批號：20140601，20140801)；復方安吉杷爾糖漿(批號：20140901，20141101)；瑪里抗瘤丸(批號：20140701，20141101)；加瓦日西昆都爾蜜膏(批號：20141101，20141201)均有新疆喀什地區莎車縣維吾爾醫醫院提供。止痛蘇潤江片(批號：20150101，20150102)；復方合牙日仙拜爾片(批號：20150101，20150202)；止咳祖帕片(批號：20150101，20150102)；那尼花米西克片(批號：20150101，20150102)；清血吾血白片(批號：20150101，20150102)均有新疆和田地區維吾爾醫醫院提供

1.3 培養基:營養瓊脂培養基(批號：110105)、玫瑰紅鈉瓊脂培養基(批號：1012152)、營養肉湯培養基(批號：101213)、膽鹽乳糖增菌液批號：(1211222)、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：1404242)、乳糖膽鹽發酵培養基(批號：101108)，營養肉湯培養基(批號：141103)均由北京三藥科技開發公司

1.4 菌株:金黃色葡萄球菌，大腸埃希菌，枯草芽孢桿菌，銅綠假單孢菌，白色念珠菌，黑曲霉，乙型副傷寒沙門菌均由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備

2.1.1 取經35℃培養18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌肉湯培養物1mL，加入9mL0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋制成50～100cfu/mL，備用。

2.1.2 取經25℃培養24～48h的白色念珠菌改良馬丁液體培養物1mL，加入9mL0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋為50～100cfu/mL，備用。

2.1.3 取經25℃培養1周的黑曲霉斜面培養物，加3mL0.9%滅菌氯化鈉洗下霉菌孢子，用帶有棉花的吸管取出菌液，用0.9%滅菌氯化鈉溶液10倍稀釋制成50～100cfu/mL，備用。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 口服液體供試品：取樣品10mL，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，混勻，制成1:10的供試液。

2.2.2 口服固體供試品：取樣品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，混勻，制成1:10的供試液。

2.2.3 外用液體供試品：取樣品10mL，加含2%吐溫-80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，混勻，制成1:10的供試液。

2.2.4 外用固體供試品：取樣品10g，加含2%吐溫-80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，混勻，制成1:10的供試液。

2.3 驗證方法

2.3.1 細菌、霉菌和酵母菌計數法回收率的測定。

2.3.1.1 試驗組：平皿法：取1mL1：10供試品溶液和50～100cfu菌液注入1個平皿中，迅速倒入15～20mL45℃左右的瓊脂培養基，每個菌株制備2個平皿。細菌在35℃培養箱中培養3d，霉菌在25℃培養箱中培養5d，計數，取平均值。

培養基稀釋法：取0.2mL/皿1：10供試品溶液和50～100cfu菌液注入1個平皿中，照常規法進行試驗。

薄膜過濾法：取1：10供試液1mL加入薄膜過濾器中，沖洗液100mL/膜，在最后一次沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，后取膜貼于瓊脂平板，按薄膜過濾法測定其菌數。

2.3.1.2 菌液組：測定所加的試驗菌數。

2.3.1.3 供試品對照組：取規定量供試品溶液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。

2.3.1.4 稀釋劑對照組：取相應的稀釋液代替供試品溶液，加入試驗菌，按試驗組方法測定其菌落數。

回收率(%)=(試驗組菌數-供試品組菌數)/菌液組菌數×100%

2.3.2 控制菌檢驗方法驗證

2.3.2.1 大腸埃希菌：取供試液10mL及10～100cfu大腸埃希菌加至100mL膽鹽乳糖增菌液中，培養18～24h后，按《中國藥典》2010年版控制菌檢驗方法檢查。

2.3.2.2 大腸菌群：取供試液1.0mL及10～100cfu大腸埃希菌加至10mL膽鹽乳糖發酵培養基中，培養18～24h后，按《中國藥典》2010年版控制菌檢驗方法檢查。

2.3.2.3 沙門菌：取供試液10mL及10～100cfu金黃色葡萄球菌加至200mL營養肉湯培養基中，培養18～24h后，按《中國藥典》2010年版控制菌檢驗方法檢查。

2.3.2.4 金黃色葡萄球菌：取供試液10mL及10～100cfu金黃色葡萄球菌加至100mL營養肉湯培養基中，培養18～24h后，按《中國藥典》2010年版控制菌檢驗方法檢查。

2.3.2.5 銅綠假單孢菌：取供試液10mL及10～100cfu銅綠假單孢菌加至100mL膽鹽乳糖增菌液培養基中，培養18～24h后，按《中國藥典》2010年版控制菌檢驗方法檢查。

2.4 結果

2.4.1 常規法測定3家醫院15種供試品的回收率，進行3次獨立平行試驗，稀釋劑對照組回收率均高于70%，試驗組結果見表1。復方比黑馬爾江膠囊、黑種草子油、依提爾菲力開西尼孜丸、小茴香露劑、復方安吉杷爾糖漿、止咳祖帕片、清血吾血白片采用常規法5種試驗菌的回收率均高于70%，證明無抑菌現象。加瓦日西庫木尼蜜膏、驅白馬日白熱斯丸、瑪里抗瘤丸、加瓦日西昆都爾蜜膏、止痛蘇潤江片等5種對枯草芽孢桿菌有明顯抑制作用，其中加瓦日西昆都爾蜜膏采用薄膜過濾法(100mL/膜)可消除其抑菌作用，其他4種采用培養基稀釋法(0.2mL/皿)可消除其抑菌作用。艾合米爾散、復方合牙日仙拜爾片、那尼花米西克片對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有明顯抑制作用，采用培養基稀釋法(0.2mL/皿)可消除其抑菌作用。

表1 15種維藥醫院制劑微生物限度檢查方法驗證結果

2.4.2 15種樣品控制菌檢查均可采用常規法進行檢驗，說明對各類控制菌均無抑制作用。

表2 控制菌檢查方法驗證結果

3 討論

3.1 細菌、霉菌及酵母菌及控制菌檢查方法的確立：通過對15種維藥醫院制劑微生物限度檢查法的建立研究，表明對于細菌、霉菌及酵母菌的檢驗，復方比黑馬爾江膠囊、黑種草子油、依提爾菲力開西尼孜丸、小茴香露劑、復方安吉杷爾糖漿、止咳祖帕片、清血吾血白片可采用平皿法(1mL/皿)，加瓦日西庫木尼蜜膏、驅白馬日白熱斯丸、瑪里抗瘤丸、止痛蘇潤江片、艾合米爾散、復方合牙日仙拜爾片、那尼花米西克片可采用培養基稀釋法(0.2mL/皿)，加瓦日西昆都爾蜜膏采用薄膜過濾法(100mL/膜)進行檢驗。15種維藥醫院制劑控制菌檢查均采用常規法。

3.2 方法確立結果的討論：通過方法學驗證試驗，能有效地消除或減弱制劑中抑菌成分的影響，增加了實際用藥檢測的方法借鑒和數據支持，使檢測結果與實際更接近，進一步說明了維藥醫院制劑微生物檢查方法驗證的必要性和重要性。

3.3 小結：本研究采用中國藥典規定的藥品微生物限度檢查方法對15種維藥醫院制劑微生物限度檢查方法進行驗證，藥品微生物限度檢測是反映藥品質量的重要依據。藥品出現微生物污染會導致患者出現嚴重的腸道反應、甚至引發失明、敗血癥等嚴重后果[8]。目前，新疆維吾爾自治區共有民族醫醫療機構48家，民族醫醫療機構制劑室22個，可配制制劑品種1545個，新疆民族藥事業發展步入了標準化、規范化軌道。民族藥標準化帶來的是人們群眾的用藥安全，是市場對民族藥產品的認可，科學合理地制定民族藥質量標準，將對推進民族藥及其生產的規范化、標準化、現代化產生積極而深遠的影響[9]。開展民族藥研究，對于保證和提高民族藥用藥安全，促進各民族間文化交流和地區經濟發展，將發揮極大作用[10]。藥品安全性是臨床應用的重要前提以及必要保證，其對于避免將受到微生物污染的制劑應用于人體，危害患者生命安全具有重要意義。因此，依據相關規定對藥品進行無菌檢測是保證患者用藥安全的必要環節[11]。

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2016年11月29日收稿

The microbial limit test of 15 Uighur medicine hospital preparations.

HAO Juan CHANG Jin WANG Yi

(Kashi district institute for food and drug control in Xinjiang)

Objective To establish a method for the microbial limit test of 15 Uighur medicine hospital preparations.Methods A validation on the microbial limit test method was conducted in accordance with the counting method of bacteria,mycetes and yeasts and the control bacteria test method stated in the Appendix of China Pharmacopoeia (2010 edition).Results The recoveries of five test organisms were higher than 70%,the control microorganisms were properly detected .Conclusion Uighur medicine hospital preparations should undergo validation with the microbial limit test method to ensure the correctness of test results.

Uighur medicine hospital preparations;microbiallimit;validation of method;recovery rate

R291.5

B

1006-6810(2017)04-0039-04