蒙藥地格達-4味湯在D-GlaN致急性肝損傷大鼠血清移行成分的LC-MSDTrap分析Δ

巴根那 包明蘭 白梅榮 何那拉 佟玉風 葉日貴

(內蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院，內蒙古 通遼 028000)

實驗研究

蒙藥地格達-4味湯在D-GlaN致急性肝損傷大鼠血清移行成分的LC-MSDTrap分析Δ

巴根那 包明蘭*白梅榮 何那拉 佟玉風 葉日貴

(內蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院，內蒙古 通遼 028000)

目的：分析蒙藥地格達-4味湯在D-GlaN致急性肝損傷大鼠血清移行成分。方法：以地格達-4味湯水提物為示例藥物、以D-GlaN致急性肝損傷大鼠為研究對象，應用液質聯(lián)用儀和核磁共振儀對急性肝損傷大鼠灌胃給藥地格達-4味湯后的血清中移行成分進行LC-MSDTrap分析。結果：灌胃給藥地格達-4味湯后，在以D-GlaN致急性肝損傷大鼠血清中供檢測到9個移行成分，其中4個移行成分為地格達-4味湯原型成分，即，4-O-β-glucopyranosylacetophenone、草夾竹桃苷、獐牙菜苦苷、Sweroside；5個移行成分為代謝產(chǎn)物。結論：所建立的測定方法比較全面、系統(tǒng)地分析地格達-4味湯血中移行成分，為揭示地格達-4味湯抗急性肝損傷藥效物質基礎提供科學依據(jù)。

蒙藥地格達-4味湯；急性肝損傷；血清；移行成分；LC-MSDTrap分析

蒙藥地格達-4味湯始載于《診治明醫(yī)典》，1998年被載入《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·蒙藥分冊》是蒙醫(yī)臨床常用于清熱、保肝、利膽的復方制劑。本復方由肋柱花、胡黃連、梔子、瞿麥等4味藥材組成，具有清血熱、分解精華與糟粨等功效。主要用于血熱相搏、肝膽熱、咽喉腫痛，口渴干燥等多種病癥[1]。目前，地格達-4味湯的研究主要集中在保肝藥理作用及獐牙菜苦苷、胡黃連苷II及梔子苷等主要化學成分的動態(tài)變化方面[2-4]，而地格達-4味湯保肝藥效物質基礎尚未清楚。

藥物起作用的前提是必須被吸收入血。因此，本文從藥物的臨床應用為切入點，分析地格達-4味湯在D-GIaN致急性肝損傷大鼠(病態(tài)))血清中的移行成分，為后續(xù)探討地格達-4味湯體內直接作用物質與藥效相關性研究提供基本信息數(shù)據(jù)，為揭示地格達-4味湯保肝作用的物質基礎提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器：Agilent 1100 series LC-MSD液質聯(lián)用儀(Agilent SL型多級離子阱質譜儀，低壓四元梯度泵，二級管陳列檢測器(DAD)，chemistation化學工作站)；KQ-200VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山)；NA-5L氮氣空氣一體機；TD4-I型離心機(長沙)；AUW120D型分析天平(上海)；固相萃取小柱-WAT094226? Waters OAsis HLB 3cc/60mg，30um(上海)。

1.2 藥品與試劑：地格達-4味湯自制(肋柱花采自扎魯特旗自然保護區(qū)特金罕山，經(jīng)內蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院布和巴特爾教授鑒定，是龍膽科植肋柱花Lomatogonium carinthiacum (Wulf) Reichb.的干燥全草；胡黃連、梔子、瞿麥：內蒙古通遼市澤強醫(yī)藥有限公司提供)。D-GlaN(批號58461)由美國，Sigma公司提供。色譜2甲醇，甲酸。

1.3 實驗動物：取Wistar大鼠，SPF級，雄性，許可證號碼：SCXK(吉)-2011-0004：長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供。

2 分析條件

2.1 色譜條件：色譜柱：VenusilMPC18(4.6*300mm，5μm)；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫(0～10min，10～20%B；10～20min，20～40%B；20～40min，40～60%B；40～60min，60～75%B；60～80min，75～85%B；80～90min，85～10%B)；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：280nm；柱溫：35℃；進樣量：30μL。

2.2 質譜條件：ESI電離源：電噴霧離子源；檢測模式：正離子掃描；掃描范圍：m/z50～800；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流量：9.0mL·min-1；霧化氣壓強：35.0psi(1psi=6.895kpa)；毛細管電壓：4kv。

3 實驗方法

3.1 D-GlaN致急性肝損傷模型的復制：取20只大鼠，體重220±10g，按體重隨機分為空白組、模型組，每組10只，模型組按400mg·kg-1劑量腹腔注射D-GlaN生理鹽水染毒造模，空白組灌胃等量生理鹽水，禁食不禁水21h后，從腹主動脈取血，3000r·min-1離心10min，取上清液，檢測ALT、AST血清指標[5]，結果見表1。

表1 D-GlaN致急性肝損傷模型血清ALT、AST 含量的影響

注：與空白組比較*P<0.05；

3.2 含地格達-4味湯血清樣品的制備：取30只大鼠，體重220±10g，按體重隨機分為空白組、模型組、藥物組，每組10只，模型組與藥物組按“3.1”方法水染毒造模，造模成功后，藥物組按1.44g·kg-1(按提取率換算)劑量灌胃地格達-4味湯水提物，空白組灌胃等量生理鹽水，給藥45min后，從腹主動脈取血，3000r·min-1離心10min，取上清液，備用。

3.3 含地格達-4味湯血清樣品的處理：分別精密吸取含地格達-4味湯組血清、空白組血清和模型組血清各500μL，用20μL85%的磷酸酸化后加入活化(2mL甲醇、2mL水)的HLB固相萃取柱，分別以2mL水、2mL10%甲醇和3mL70%甲醇洗脫，棄去前兩段洗脫液，收集70%的甲醇洗脫液，氮氣發(fā)生儀上吹干樣品[6]。用200μL甲醇溶解，過0.22μm微孔濾膜，制備相應的含地格達-4味湯組血清、空白組血清和模型組血清樣品，備用。

3.4 地格達-4味湯血清中移行成分的LC-MSDTrap分析：精密吸取含地格達-4味湯組、空白組和模型組血清樣品溶液各30μL，按“2”分析條件進行檢測。記錄相應的總離子圖和二級質譜圖，結果見表2和圖1～10。

表2 地格達-4味湯血清中移行成分的正離子 掃描模式的質譜分析結果

圖2 1號移行成分的結構 圖3 2號移行成分的結構

圖4 3號移行成分的結構 圖5 4號移行成分的結構

圖6 5號移行成分的結構 圖7 6號移行成分的結構

圖8 7號移行成分的結構 圖9 8號移行成分的結構

圖10 9號移行成分的結構

4 實驗結果

4.1 D-GlaN致急性肝損傷模型血清ALT、AST含量：與正常組比較，模型組的血清ALT、AST活性明顯升高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示模型復制成功。

4.2 地格達-4味湯血清中移行成分的LC-MSDTrap分析結果：應用LC-MS分析含地格達-4味湯組、空白組和模型組血清樣品，比較了質譜檢測方式，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，質譜響應更強，并且峰容量更大，故選擇ESI正離子模式。

鑒定過程在本次實驗色譜條件下，含地格達-4味湯血清中共檢測到13個移行成分峰，除了空白組和模型組血清固有移行成分以外，含地格達-4味湯血清中與藥物有關的有9個移行成分，其中4個移行成分是地格達-4味湯原型成分、5個移行成分是體內產(chǎn)生的代謝物(圖1)。對這些移行成分首先精確計算出ESI-MS上所得化合物的分子質量，初步鑒定其化學成分[7-10]。然后，選擇合適的分子離子峰進行裂解，通過二級質譜裂解方式，獲得與化合物結構相關的碎片離子，再對比其他碎片信息，結合紫外吸收波長、分子質量、碎片離子峰、保留時間等參數(shù)，進一步推斷5個代謝產(chǎn)物的結構；根據(jù)1H-NMR、13C-NMR及相關文獻報道數(shù)據(jù)確定4個原型成分的結構(表2和圖2-10)。

以獐牙菜苦苷為例。首先，通過該峰的準分子離子峰m/z397.5，可確定其目標分子量為374.1，根據(jù)m/z397.5的二級質譜裂解圖進行分析，發(fā)現(xiàn)所得二級質譜圖(圖11)中有明顯的m/z379.3[M+ Na-OH]+、217.1[M+Na-OH-C6H10O5]+、255.1[M+Na-OH-C6H4O3]+、165.1[M+Na-OH-C6H4O3-C7H10O3]+等碎片離子信息，從而推斷出其裂解途徑(圖12)。結合保留時間、紫外吸收波長、碎片離子等參數(shù)，最終確定該峰為獐牙菜苦苷。采用類似的方法，對其他移行成分也進行相應的鑒定。

圖1 含地格達-4味湯組(A)、模型組(B)及 空白組(C)血清總離子流圖

圖11 獐牙菜苦苷二級質譜圖

圖12 獐牙菜苦苷裂解途徑

5 討論

藥物口服后，多數(shù)所含成分不能被吸收，只有部分成分被吸收進入體內，而進入體內的成分既可能以原型，也可能以代謝物的形式發(fā)揮作用。真正起作用的是吸收入血的成分，即血清中的移行成分。另外，由于蒙藥成分較復雜，有些成分在肝臟的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶的作用下生物轉化為代謝產(chǎn)物后才能更具有較強的生理活性。因此，從含地格達-4味湯血清中分析得到的以上9個血中移行成分可能是地格達-4味湯化學成分的體內作用形式，它們最有可能成為地格達-4味湯的抗急性肝損傷藥效物質基礎。但被吸收入血的成分不一定都是有效成分，所以血中移行成分的活性與地格達-4味湯臨床療效的相關性，還有待進一步研究。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·蒙藥分冊[S].1998.91.

[2]巴根那，高玉峰，青玉，等.蒙藥地格達-4味湯對小鼠化學性肝損傷的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20(12)：3031～3033.

[3]高玉峰，巴根那，巴圖德力根，等.蒙藥地格達-4味湯對D-GlaN致小鼠急肝損傷的保護作用[J].中國中醫(yī)藥科技，2010，17(1)：26～27.

[4]白梅榮，巴根那，拉喜那木吉拉，等.地格達-4味湯中獐牙菜苦苷在急性肝損傷模型大鼠體內藥代動力學研究[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(6)：125～128.

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[6]王喜軍.中藥血清藥物化學[M].科學出版社，2010.109.

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2016年12月15日收稿

LC-MSD Trap Analyze the transitional components of Mongolian medicine Digeda-4 in serum of acute liver injury of rats induced by D-GIaN ba-genna Bao-minglan*bai-meirong he-nala tong-yufeng ye-rigui

(College of Mongolian Medicine and Pharmacology，Inner Mongolian

University for Nationalities，Tongliao，Inner Mongolia 028000，China)

Objective:To analyze the transitional elements of Digeda-4 denoction in serum after administration of stomach.Methods:With extract is an example of drugs to D-GlaN induced acute liver injury in rats as the research object，The application of LC-MS and NMR on acute liver injury in rats after intragastric administration of LC-MSD Trap placeality analysis of transitional components of -4 Decoction in the serum.Results:After administration of stomach for the Digeda-4，The nine transitional elements were detected in rat serum，four transitional elements were the Digeda-4denoction's prototype components that 4-O-β-glucopyranosyl，Phlox glycosides，Swertia bitter glycosides，Sweroside，5 transitional components were metabolites.Conclusion:The established method could comprehensively systematically analyze the transitional elements of Digeda-4 denoction in blood，to reveal to Digeda-4 decoction provide a scientific basis for anti-liver injury in acute pharmacodynamic material basis.

Mongolian medicine Digeda-4 decoction;acute liver injury;serum;the analyze of transitional elements:LC-MSD Trap Analysis

國家自然基金項目(81360673)

巴根那(1960-)男，教授，博士，博士生導師，研究方向：蒙藥新藥開發(fā)研究，bagenna@126.com;

*通訊作者：包明蘭(1979-)女，副教授，博士，研究方向：方劑作用機理研究，baominglan@126.com

R291.2

A

1006-6810(2017)04-0046-04