HPLC法同時測定連花柴芩可溶性粉中4種有效成分含量

張麗先，魏悅，曹靜亞，王志堯，王學方，李曉*

(1. 河南科高中標檢測技術有限公司，鄭州 450002; 2. 河南省科高植物天然產物開發工程技術有限公司，鄭州 450002)

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HPLC法同時測定連花柴芩可溶性粉中4種有效成分含量

張麗先1，魏悅1，曹靜亞1，王志堯2，王學方2，李曉2*

(1. 河南科高中標檢測技術有限公司，鄭州 450002; 2. 河南省科高植物天然產物開發工程技術有限公司，鄭州 450002)

建立了HPLC法同時測定連花柴芩可溶性粉中綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A及黃芩苷的含量。采用Venusil XBP C18分析柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈～0.1%磷酸水為流動相，1.0 mL/min的流速下進行梯度洗脫，320 nm波長處對4種成分進行含量測定。結果表明，在此色譜條件下，4種組分分離度良好，分別在3.28～26.24 μg/mL、3.17～25.36 μg/mL、6.08～48.64 μg/mL及8.81～70.48 μg/mL范圍內線性關系良好，加樣回收率均大于96.61 %，RSD均小于1.75 %。該方法簡便、快速、準確，重復性良好，可用于連花柴芩可溶性粉中綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A及黃芩苷的同時測定。

連花柴芩可溶性粉；含量測定；高效液相色譜法

連花柴芩可溶性粉是針對禽病毒性呼吸道疾病、以“清熱解毒、宣肺止咳”為治療原則，通過臨床篩選、科學組方，研制的純中藥制劑，由連翹、山銀花、柴胡、黃芩、甘草等藥味組成。前期研究表明，連花柴芩可溶性粉具有明顯的抗炎解熱、止咳祛痰以及免疫增強等作用[1-2]，臨床用于畜禽病毒性呼吸道疾病的預防和治療，效果良好。連花柴芩可溶性粉藥味眾多，成分復雜，建立可靠的方法對其進行質量控制勢在必行，多指標含量測定質量控制體系在增加復方制劑質量可控性、保證產品質量、確保制劑穩定性、安全性及有效性方面具有重要現實意義[3]，本試驗采用高效液相方法對連花柴芩可溶性粉中4種有效成分的含量進行同時測定，為該產品的質量可控性提供了重要的技術依據，以期為進一步建立其質量標準提供重要參考。

1 材 料

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀(包括CMA-20A系統、LC-20AT二元高壓泵、SIL-20A自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-M20A檢測器、LC Soulation工作站)，ME204梅特勒電子天平，島津AUW 220D十萬分之一天平，昆山KQ-500超聲儀。

1.2 試劑與樣品 3批連花柴芩可溶性粉(由河南科高植物天然產物開發工程技術有限公司提供，批號為20140324、20140325、20140326)。綠原酸對照品(批號為110753-200413)、甘草苷對照品(批號為111610-201106)、連翹酯苷A對照品(批號為111810-201001)、黃芩苷對照品(批號為110715-200815)，均購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇、乙腈(色譜純)，磷酸(分析純)，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸5.12 mg，甘草苷4.96 mg，連翹酯苷A 9.50 mg，黃芩苷13.76 mg，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為102.4 μg/mL綠原酸，99.2 μg/mL甘草苷，190 μg/mL連翹酯苷A和275.2 μg/mL黃芩苷的混合對照品儲備液，精密移取上述儲備液3.2 mL至10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為32.77 μg/mL綠原酸，31.74 μg/mL甘草苷，60.8 μg/mL連翹酯苷A和88.06 μg/mL黃芩苷的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備方法 取本品0.2 g，置50 mL容量瓶中，加入50%甲醇，定容搖勻，超聲處理30 min，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45 μm膜，得供試品溶液。

2.3 色譜條件 Venusil XBP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈(B)～0.1%磷酸水溶液(A)為流動相，梯度洗脫程序為：0～10 min 9%～13.5% B，10～13 min 13.5%～16.2% B，13～25 min 保持16.2% B，25～27 min 16.2%～19.8% B，27～32 min 19.8%～21.6% B，32～38 min 21.6%～31.5% B，38～40 min 31.5%～36% B，40～55 min 36%～45.9% B，55～60 min 45.9%～75% B；流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測波長為320 nm，進樣量為10 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍 精密移取1、2、4、6、8 mL的混合對照品溶液，分別置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度。按2.3項色譜條件分別進樣，記錄色譜圖(圖1)，以峰面積 (y)對進樣濃度(x)進行線性回歸，得到4種有效成分的線性回歸方程(表1)。

2.4.2 精密度考察 取同一混合對照溶液，連續重復進樣6次，記錄峰面積，并計算相對標準偏差(RSD)。綠原酸的RSD為0.64%，甘草苷的RSD為1.26%，連翹酯苷A的RSD為0.89%，黃芩苷的RSD為0.92%，表明儀器精密度良好，滿足檢測需要。

圖1 混合對照品的HPLC色譜圖 (1：綠原酸，2：甘草苷，3：連翹酯苷A，4：黃芩苷)Fig 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(1. chlorogenic acids, 2. liquiritin, 3. forsythoside A, 4. baicalin)

成分名稱保留時間/min標準曲線線性范圍/(μg·mL-1)相關系數R2綠原酸11.621y=31921x-56783.28～26.240.9999甘草苷24.417y=6636x+993.17～25.360.9998連翹酯苷A26.146y=14754x-43436.08～48.640.9999黃芩苷41.790y=23201x+151988.81～70.480.9999

2.4.3 重復性考察 取20140324批次連黃柴芩粉，按2.2項平行制備供試品溶液6份，分別按2.3項中色譜條件測定綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A和黃芩苷含量。結果綠原酸的含量分別為3.82、3.79、3.85、3.81、3.86、3.88 mg/g，甘草苷的含量為1.03、1.06、1.02、1.06、1.05、1.02 mg/g，連翹酯苷A含量為3.28、3.19、3.31、3.26、3.28、3.35 mg/g，黃芩苷含量為14.42、14.45、14.35、14.28、14.37、14.49 mg/g，RSD分別為0.88%、1.82%、1.63%、0.52%，RSD均小于1.82 %，表明該方法重復性良好。

2.4.4 穩定性考察 取同一份供試品溶液，分別于配制完成后0、4、8、12、24 h進樣1次，記錄峰面積。結果綠原酸峰面積的RSD為1.98%，甘草苷峰面積的RSD為1.65%，連翹酯苷A 峰面積的RSD為1.24%，黃芩苷峰面積的RSD為0.87%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.5 加樣回收率 準確稱取同一已測知含量的連花柴芩可溶性粉樣品6份，各0.1 g，置于50 mL量瓶中，分別準確加入相應量的綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A及黃芩苷對照品溶液，加50%甲醇至刻度，搖勻，超聲30 min，放冷，定容并搖勻，過0.45 μm濾膜，得加樣回收率供試品溶液，進行含量測定，計算加樣回收率及RSD，結果見表2～表5。綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A及黃芩苷平均回收率分別為97.44%、96.91%、96.61%、98.61%，RSD分別為1.52%、1.18%、1.75%、1.67%，結果表明該方法準確度良好。

2.4.6 專屬性考察 取按2.2項方法分別制備的連花柴芩可溶性粉去除山銀花、甘草、連翹、黃芩的陰性供試液，上述色譜條件下分別進樣分析(圖2)，從圖中箭頭指向的相應目標物出峰處可看出，山銀花、甘草、連翹、黃芩陰性供試液分別在綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A、黃芩苷出峰處無干擾，表明該方法可以用于4種有效成分定量。

2.5 樣品測定 取批號為20140324、20140325、20140326的3批連花柴芩可溶性粉，分別按2.1項制備3份平行供試品溶液，按上述方法進行含量測定，HPLC色譜圖見圖3，外標法計算綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A及黃芩苷的含量，并計算其RSD，結果見表6，RSD值均小于2.0%。

表2 綠原酸加樣回收試驗結果(n=6)Tab 2 Recovery results of chlorogenic acids (n=6)

表3 甘草苷加樣回收試驗結果Tab 3 Recovery results of liquiritin (n=6)

表4 連翹酯苷A加樣回收試驗結果Tab 4 Recovery results of forsythoside A(n=6)

表5 黃芩苷加樣回收試驗結果Tab 5 Recovery results of baicalin (n=6)

圖2 陰性對照HPLC色譜圖(a. 山銀花陰性，b.甘草陰性，c. 連翹陰性，d. 黃芩陰性)Fig 2 HPLC chromatograms of negative control. (a. Lonicera confusa negative control, b.Glycyrrhiza uralensis negative control, c. fructus forsythiae negative control, d. Scutellaria baicalensis negative control)

圖3 連花柴芩可溶性粉HPLC色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms of Lian-hua-chai-qin soluble power

批號綠原酸甘草苷連翹酯苷A黃芩苷含量/(mg·g-1)RSD/%含量/(mg·g-1)RSD/%含量/(mg·g-1)RSD/%含量/(mg·g-1)RSD/%201403243.841.521.041.863.280.9214.400.68201403255.600.671.521.695.261.3415.011.16201403268.400.791.961.787.241.2021.701.48

3 討論與小結

3.1 測定成分的選擇 復方制劑的藥效是多組分共同作用的結果，單一成分的含量不能整體綜合的反映復方制劑的質量[4]，在選擇定量指標時綜合考慮連花柴芩可溶性粉所含的活性成分、君藥的特征成分等特點[5-6]，有針對性的選擇了綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A、黃芩苷4個指標成分，以多方面監控連花柴芩可溶性粉的質量。

3.2 樣品前處理方法的選擇 提取方法的選擇，考察了回流法和超聲法，鑒于回流法操作煩瑣，且綠原酸受熱不穩定[7]，采用操作簡便的超聲法。對比了30%甲醇、50%甲醇和純甲醇為提取溶劑以及10、20、30 min超聲時間對4目標分析物的提取效率，結果以50%甲醇為溶劑，超聲30 min效果最好。

3.3 檢測波長的選擇 由4種目標成分的紫外圖譜可得，綠原酸的最大吸收在326 nm，連翹酯苷A最大吸收波長為328 nm，甘草苷最大吸收在276 nm處，次吸收波長在312 nm，黃芩苷在277 nm處有最大吸收，次吸收在317 nm，綜合考慮色譜峰響應值及分離度，最終選擇320 nm作為檢測波長。

3.4 流動相的選擇 基于綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷自身的酸堿性，酸性環境中3種組分良好的穩定性能[7-9]，以及磷酸對甘草苷良好的分離效果[10]，本試驗分別考察了甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水以及不同比例磷酸對指標成分分離度的影響。以甲醇為有機相色譜峰基線不平穩，對于指標成分的準確定量有影響，以乙腈為有機相可避免此問題；分別考察了0.05%、0.1%、0.2%、0.5%磷酸水溶液對色譜峰的分離效果，發現0.1%、0.2%磷酸下4指標成分的分離度、色譜峰對稱性較好，考慮到色譜柱對大比例酸的耐受能力較弱，選擇0.1%磷酸水；最終流動相選擇乙腈-0.1%磷酸水。

本試驗建立了同時測定連花柴芩可溶性粉中綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A及黃芩苷含量的HPLC方法，該方法準確、簡便，重復性好，為控制連花柴芩可溶性粉質量，確保產品批次間穩定性，建立其質量標準提供重要參考，同時該方法可進一步用于含相同藥味的其他復方制劑中綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A及黃芩苷的定性定量檢測。

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(編輯：侯向輝)

Simultaneous Determination of Four Active Components in Lian-hua-chai-qin Soluble Power by HPLC

ZHANG Li-xian1, WEI Yue1,CAO Jing-ya1, WANG Zhi-yao2, WANG Xue-fang2, LI Xiao2*

(1. Cogotesting International Company Limited, Zhengzhou 450000, China;2. Henan Plant Natural-Products Development Engineering Technology Company, Zhengzhou 450002, China)

LI Xiao E-mail: 67430218@qq.com

A new HPLC method was firstly established for simultaneous determination of caffeotannic acid,

liquiritin, forsythoside A and baicalin in Lian-hua-chai-qin soluble power. Analysis was performed on a venusil XBP C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase was considered of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid solution, the flow rate set at 1.0 mL/min and the detected wavelength was 320 nm. Results showed four substances were separated effectively, caffeotannic acid, liquiritin, forsythoside A and baicalinin had good linearity over the range of 3.28～26.24 μg/mL, 3.17～23.36 μg/mL, 6.08～48.64 μg/mL and 8.81～70.48 μg/mL, respectively. The average recoveries were higher than 96.61% andRSDall below 1.75%. The method is accurate, rapid and repeatable, can be used for simultaneous determination of caffeotannic acid, liquiritin, forsythoside A and baicalin in Lian-hua-chai-qin soluble power.

Lian-hua-chai-qin soluble power; content determination; HPLC

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.5.06

河南省科技攻關項目(152102110115)

張麗先，碩士，從事中藥質量控制研究。

李曉。E-mail: 67430218@qq.com

2016-11-25

A

1002-1280 (2017) 05-0027-06

S859.2