環境分子診斷技術在污染場地環境管理中的應用進展

文 一，張 濤，劉偉江，康 陽，陳 堅

環境保護部環境規劃院，北京 100012

環境分子診斷技術在污染場地環境管理中的應用進展

文 一，張 濤，劉偉江，康 陽，陳 堅

環境保護部環境規劃院，北京 100012

環境分子診斷技術(EMDSs)是有機單體同位素分析和各種分子生物學技術的總稱，將其應用于污染場地特征識別、修復方案可行性評估、監測和修復終止等污染場地環境管理過程中，探明土壤和地下水中污染物生物和非生物降解過程、降解速率及機制，確定不同污染來源，可彌補傳統污染場地環境管理方法的不足，具有廣闊的發展前景。文章綜述了污染場地環境管理過程及傳統方法的不足，介紹了有機單體同位素分析和各種分子生物學技術的基本原理和用途，并對各種技術的特點進行闡述和對比；介紹了EMDSs在污染場地環境管理中的實際應用，提出了EMDSs的發展趨勢。

污染場地； 環境分子診斷；有機單體同位素分析；分子生物學技術

環境分子診斷技術(EMDSs)是利用新興的同位素技術和分子生物學技術，分析土壤和地下水等環境樣本的生物和化學特征，用于污染場地特征識別、修復方案可行性評估、效果監測和修復結案等污染場地環境管理過程[1]。

按照診斷原理，環境分子診斷技術主要分為2類：基于同位素的有機單體同位素分析(CSIA)和基于DNA、RNA等的分子生物學技術(MBTs)。這些方法已經在醫藥、國防和工業領域廣泛應用，由于傳統的場地環境管理方法(如水文地質調查、化學和地球化學分析等)僅能提供污染物自然衰減是否發生或者主動污染修復的反應速率高低等間接證據，難以快速和全面支撐污染場地環境管理決策，而環境分子診斷技術通過分析涉及污染物轉化過程中的同位素、微生物、基因或者酶等微觀證據，可以提供更多有效和直接的數據，用以完善傳統管理方法的不足[2-3]。近10年來，國內外逐漸將環境分子診斷技術應用在污染場地環境管理中，據美國環保局(USEPA)統計，2009—2012年已有數百個環境修復場地在場地污染調查、監測和修復等過程中使用了環境分子診斷技術[4]。中國臺灣地區將環境分子診斷技術應用在油品類污染場地調查中，在加油站油品泄漏場地中，通過碳同位素分析、特定生物指標化合物分析，判斷油品污染的油源的差異，確定受污染的時間[5]。

在我國，環境分子診斷技術的應用和研究還處于起步階段，主要利用CSIA和MBTs對污染物的遷移轉化機制進行探索性研究，在實際污染場地環境管理中應用較少[6-8]。本文綜述了環境分子診斷技術的種類、適用性及在污染場地環境管理中運用，并提出了下一步研究的方向。

1 污染場地環境管理過程

國內外的污染場地環境管理指南或規范中，一般將污染場地環境管理分為4個階段：污染場地特征識別、污染修復、監測和修復終止[9]。污染場地特征識別的作用是確定污染類型、刻畫污染程度和空間分布、建立場地概念模型，為開展風險評估和實施地下水修復方案提供信息。污染修復包括修復方案選擇、修復工程設計、可行性評估和修復工程實施等過程。污染環境場地管理中的監測，包括監測修復技術可行性評估中的修復效果、修復工程實施過程中污染物和副產物的濃度和溶質通量變化趨勢等，以評價修復的實際效果。污染修復終止是指當實施修復工程后，場地的土壤、水和土壤氣等環境介質中污染物的濃度不會對人群及環境產生危害時，停止污染場地修復行動。

傳統的污染場地環境管理是通過對土壤和地下水等環境樣品的采樣分析，獲得污染物和副產物的濃度和溶質通量的變化趨勢，為環境管理各階段提供決策信息。土壤和地下水環境樣品的傳統分析方法存在局限性，例如，傳統的污染物分析利用氣相色譜或者氣質聯用定量污染物的含量，僅能提供少量的污染物信息，且無法提供污染物的同位素信息，而污染物的同位素變化是表征污染來源、降解速率和降解機制的可靠指標；在生物分析上，傳統方法是利用異養菌平板計數法或者最大近似數分析法估計微生物的數量和生物降解的可能性，然而近99%的微生物不能在實驗室接種培養，基于平板培養的方法并不能充分評估參與污染物生物降解的微生物菌落的規模和組成[10]。因此，傳統的方法無法精確判斷目標污染物發生的生物和非生物過程的降解機理、降解速率和降解效果，也不能有效區分污染物來源[11]，難以快速和準確地為污染特征識別、污染修復效果確定和修復技術調整等提供數據支持。

采用環境分子診斷技術作為污染場地環境管理過程中傳統方法的補充，可以從多種疑似污染來源中準確判斷污染來源[12-13]，可以提高對污染場地環境中微生物群落及其降解污染物能力的了解[13]，掌握降解污染物的非生物過程及機制[14]，提供詳細的生物和非生物降解發生和反應速率等信息[15]，確定監測自然衰減或者主動修復策略，估計滿足修復目標達到的時間，為污染場地環境管理各階段提供有效和更直接的數據支撐。環境分子診斷技術在污染場地環境管理的各階段的應用見圖1。

圖1 環境分子診斷技術在污染場地環境管理各階段中的應用Fig.1 Potential uses of EMDs in site management

2 環境分子診斷技術的介紹

環境分子診斷技術的類別見圖2。

2.1 有機單體同位素分析技術

有機污染物在發生化學或生物化學反應等過程中，由于動力學同位素效應導致殘留物中重同位素富集，產物中重同位素貧化[16]，可利用同位素質譜分析儀或者同位素質譜儀與氣相或液相色譜聯用等方法測定殘留物中特定元素重同位素的富集值(或產物中重同位素貧化)，以判斷目標污染物是否發生轉化[17]。目前，在單體碳同位素中應用較多的元素為氫(2H/1H)、碳(13C/12C)、氮(15N/14N)、氧(18O/16O和17O/16O)和氯(37Cl/35Cl)[18]。

在污染場地環境管理中，有機單體同位素分析技術可應用于監測和量化污染物的降解過程和確定環境污染物的來源。在許多非生物和生物反應過程中，由于元素的重同位素鍵強度高于輕同位素，因此輕同位素會優先從反應物中轉移到產物中(正常的同位素分餾)，而重同位素則會在殘留反應物中富集，可以通過這個過程來判斷污染物是否發生降解。以13C/12C為例，當發生降解反應時，底物中13C發生富集，其富集程度的大小與降解程度有關。HUNKELER等[19]研究苯的微生物降解時，發現底物中13C發生顯著的富集，其中δ13C值為+3.4‰(f<0.1)。在特定的環境領域下，化合物的同位素組成保持不變，可直接利用其同位素組成進行來源示蹤，確定污染物的來源。CSIA已經被廣泛應用于評價石油烴的原始來源，包括判別不同地區的原油以及通過這些原油生產的汽油[20]。SHOUAKAR等[21]通過H同位素組成，區分環境中的三氯乙烯是來自于工業三氯乙烯還是通過還原脫氯作用由四氯乙烯降解生成，工業生產的三氯乙烯中的δ2H的值為100‰或更高，高于通過四氯乙烯還原脫氯產生的三氯乙烯中的δ2H的值。由于地下水中δ2H的值為0‰或者更低，若監測到TCE中δ2H的值超過100‰，那么三氯乙烯的來源為工業生產。

2.2 分子生物學技術

通常情況下，特定的污染物在特定的微生物作用下，發生生物轉化，基于分子生物技術的環境分子診斷技術，可檢測和定量作用特定污染物的微生物，識別產生降解作用的未知微生物，確定微生物降解特定污染物的能力，基于上述能力，可以用來確定污染物的降解機理和降解效率，為污染場地環境管理提供數據支持。目前，運用在污染場地環境管理的分子生物學技術包括定量聚合酶鏈式反應(qPCR)、微生物指紋圖譜、DNA微探針陣列、穩定同位素探針(SIP)、酶活性探針(EAPs)和熒光原位雜交(FISH)[4]，各種技術的原理和用途見表1。

2.3 環境分子診斷技術的適用性

環境分子診斷技術中包含了多種技術，可以提供不同或相似的環境場地管理信息，在實際使用中，需要根據不同技術的優缺點、費用和技術成熟度(見表2)，選擇合適的技術在實際污染場地環境管理中運用，如CSIA除了提供監測和量化污染物的降解過程外，還能確定環境污染物的來源，分子生物學技術主要用于提供污染物降解過程中功能微生物的種類、數量和活性等信息。在分子生物學技術中，有些技術可以提供相同的信息，如qPCR、FISH等都能提供微生物基因序列信息。環境分子診斷技術的測試費用為225～5 000美元，技術成熟度也有商業可利用或者還處于實驗室研究階段之分[1,4]。

表1 基于分子生物的環境分子診斷技術

表2 環境分子診斷技術的適用性

2.4 在污染場地環境管理中的應用

環境分子診斷技術已經應用于多環芳烴、石油烴、氯代烴、農藥殘留物等有機污染場地的場地特征識別、修復可行性評估以及修復效果的判定[30]。表3概括了近年來CSIA在污染場地環境管理中實際應用案例，從實際應用可以看出，CSIA在氯代烴污染場地的應用最為廣泛，并且涉及了污染場地環境管理的各個階段。以新澤西州受三氯乙烯污染地下水的航空基地的場地特征識別為例，前期的地下水采樣分析結果表明，該場地存在2個明顯的地下水氯代烴高值區，但不能確認是否存在2個污染源。利用CSIA技術分析地下水中δ13C，結果發現，高值區中的δ13C分別為-38.83‰和-32.44‰，存在明顯差異，表明存在2個明顯的污染源[4]。

3 結語

目前，隨著我國工業化進程的發展與擴大，在華北平原、長三角和珠三角等地下水使用量大或者經濟發達的地區出現了大量的土壤與地下水污染場地，尋求有效的方法，開展快速、準確和有效的環境管理迫在眉睫。從國外研究成果與實際應用來看，環境分子診斷技術在污染場地特征識別、污染修復、監測和修復終止等污染場地環境管理中發揮了重要的作用，從污染溯源、確定生物和非生物降解作用、效果和機制方面提供更多有效和直接的數據，可完善傳統環境管理方法的不足，提高環境管理決策的效率和準確度，因此，將環境分子診斷技術運用到我國污染場地環境管理中是一個重要的發展方向。我國在應用環境分子診斷技術方面具備了良好的基礎，同位素分析技術和分子生物學技術已經廣泛應用于我國醫藥、工業領域，具備完備的技術和硬件條件，并實現了商業利用，將其利用到污染場地環境管理中具有較高的經濟和技術可行性。下一步需要研究不同污染物在污染場地環境介質中遷移轉化過程中同位素的反應類型和分餾機理，不同污染物的降解過程與微生物的DNA、代謝蛋白質等的相互關系，使技術能應用到實際污染場地環境管理中。

表3 環境分子診斷技術的實際應用案例

環境分子診斷技術也存在一定的局限性，CSIA目前僅能分析整個污染物中的同位素組成，而不能定位污染物中特定位置的原子；另外，CSIA技術主要用于有機污染物的場地環境管理中，在重金屬污染物的場地環境管理中應用較少，今后可加強它們的研究，拓寬CSIA技術的適用范圍，進一步確定有機和重金屬環境污染物的遷移轉化機制，為污染場地環境管理提供更多的數據支撐。在分子生物學技術上，隨著高通量生物學技術的發展，將宏基因組學、環境轉錄組學、代謝組學、蛋白質組學和高通量測序等新手段應用于污染場地環境管理中是新的發展方向，這些技術能分析環境中全部的微生物群落的結構和功能，可以迅速分析多種環境樣品，提供更全面和快速的環境微生物群落生物降解過程的信息。

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Application of Environmental Molecular Diagnostics in Environmental Management of Contaminated Site

WEN Yi， ZHANG Tao， LIU Weijiang， KANG Yang， CHEN Jian

Chinese Academy for Environmental Planning, Beijing 100012, China

Environmental molecular diagnostics (EMDSs) is a series of techniques by combining chemical techniques, specifically compound specific isotope analysis (CSIA), and a variety of molecular biological techniques (MBTs), which have application in each phase of environmental site management, including site characterization identification, feasibility evaluation of remediation plan, monitoring and closure activities. EMDSs can complement these data for conventional management by providing direct measurements of the abiotic and biotic degradation process and relative rates of various degradation processes. In addition, EMDSs can be used to identify the source of contamination when several sources are suspected. The application of EMDSs has a bright prospect in environmental site management. The paper reviews the environmental management process for contaminated site and limitation of conventional methods, introduces the fundamental principal and application of EMDSs, the characteristic and the application of EMDSs, and practical application in environmental site management. Future prospect of EMDSs is also presented.

contaminated site; environmental molecular diagnostics; specifically compound specific isotope analysis; molecular biological techniques

2016-01-26;

2016-05-23

全國地下水基礎環境狀況調查評估項目(20110302)

文 一(1980-)，女，四川資陽人，博士，副研究員。

陳 堅

X830.5

A

1002-6002(2017)01- 0029- 07

10.19316/j.issn.1002-6002.2017.01.05