抗旱水稻種子轉基因成分檢測技術研究

鄧漢超 劉玉琛 鄧國標，4 劉 晉 陳惠芳 楊啟鵬 周向陽

（1深圳市農業科技促進中心，深圳 518040；2農業部農作物種子質量監督檢驗測試中心（深圳），廣東深圳 518040；3深圳市作物分子育種研究院，深圳 518107；4廣東省龍門縣衛生和計劃生育局，惠州 516800）

抗旱水稻種子轉基因成分檢測技術研究

鄧漢超1，2劉玉琛3鄧國標3，4劉 晉1，2陳惠芳1，2楊啟鵬1，2周向陽1，2

（1深圳市農業科技促進中心，深圳 518040；2農業部農作物種子質量監督檢驗測試中心（深圳），廣東深圳 518040；3深圳市作物分子育種研究院，深圳 518107；4廣東省龍門縣衛生和計劃生育局，惠州 516800）

利用組織研磨儀快速處理水稻種子樣品，采用高通量的磁珠純化系統提取樣本DNA，提取的核酸通過紫外吸收檢測其純度，應用普通PCR檢測方法和實時熒光PCR方法對水稻內源基因SPS、靶基因ATAF1進行檢測。結果表明，普通PCR方法和實時熒光PCR方法均表現快速、準確、特異性高的特點。

普通PCR；實時熒光PCR；轉基因

轉基因作物的大量種植和推廣同時對轉基因生物的檢測技術提出要求，發達國家的轉基因及相關檢測技術遠遠超過發展中的國家。美國、加拿大等國已有近百種轉基因食品上市，并且他們的目標是把大量的轉基因食品出口到發展中國家[1-3]。在這些正式獲批進行生產和貿易的產品之外，更有數目眾多的品種處于試驗階段或未經正常手續進入市場，我國已經加入WTO，正在面臨著轉基因產品貿易和安全監測的挑戰。同時隨著商品化轉基因生物的種類不斷增加，轉基因生物本身的安全性以及它們對人類健康和生態環境的潛在威脅成為國際社會和廣大民眾廣泛關注的熱點問題之一[4-6]；包括我國在內的越來越多的國家制定并實施了轉基因食品的強制標識制度。因此，轉基因產品的科學管理和應用需要得到轉基因產品及其成分檢測技術的支持。追蹤轉基因生物研發動態，研發相適應的檢測技術，制定相應的檢測標準，是轉基因生物安全監管的重要措施。本文以轉抗旱基因ATAF1水稻種子為材料，初步建立外源基因的普通PCR和實時熒光PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料 本實驗室獲得的轉ATAF1基因水稻70株，種子保存于本實驗室種子低溫低濕儲藏庫中備用。

主要儀器和試劑：MP組織研磨儀（24樣）、Themo磁珠核酸自動提取純化儀（96樣）、Omega核酸提取試劑盒、Premix Ex Taq酶、Neno1000紫外分光光度計、BIO-RAD iCycler PCR擴增儀、ABI7500實時熒光PCR擴增儀、RAININ edp3 plus排槍（12通道）等。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 水稻種子取5粒，置于2mL離心管中，放入1粒陶瓷珠，加入500μ L Buffer SLX Minus裂解液（Omega 核酸提取試劑盒）或500μL 2% CTAB 裂解液，浸泡數小時后采用MP組織研磨儀設置震蕩速度4.0 M/s、震蕩時間30s，震蕩粉碎5~6次，備用。

1.2.2 DNA的提取 磁珠自動提取法：粉碎樣品在65℃水浴1h，其間上下顛倒2~3次。12000r/min離心10min。取上清200μ L于深孔96平板、800μL Buffer PHB于深孔96平板、800深孔96平板、100深孔96平板、一個Tip按照表1依次加入Omega 核酸提取試劑盒中的試劑。啟動Themo磁珠核酸自動提取純化系統，根據系統提示依次放入上述試劑板。當DNA提取完畢，取出5號板，將DNA保存在-20℃下備用。

表1 磁珠核酸自動提取純化系統物品

1.2.3 核酸濃度及純度測定 采用Neno1000紫外分光光度法測定所提取的核酸的純度和濃度。

1.2.4 引物設計 水稻內源基因SPS基因引物設計分別參考文獻[7]。F：5′-ttgcgcctgaacggatat-3′，R：5′-ggagaagcactggacgagg-3′，產物大小277bp；ATAF1引物F：5′-TAGCCCTGCCTTCATACGCT-3′，R：5′-CGGCAGAGAACCCAATCATC-3′，產物大小580bp。特異性引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.5 PCR擴增檢測 普通PCR反應體系：20μ L反應液中含有10μ L Primex Ex Taq，0.4μ L Forward primer（10μmol/L），0.4μ L Reverse primer（10μ mol/L），2μ L模板DNA（10~50 ng/μ L），補ddH2O至20μ L。反應條件：95℃預變性2min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 40s，40個循環；72℃延伸 2min；15℃ 2min。取PCR產物5μ L加1μ L點樣液混合后點入上樣孔，于90V電壓電泳30~40min。電泳結束后，采用自動凝膠成像分析系統檢測。

實時熒光PCR反應體系：20μ L反應液中含有10μ L BIO-RAD Supermix with low ROX，0.4μ L Forward primer（10μ mol/L），0.4μ L Reverse primer（10μ mol/L），2μ L模板DNA（10~50ng/μ L），補ddH2O至20μ L。反應條件：95℃ 10s；95℃ 5s，60℃ 34s，40個循環；15℃ 2min。

2 結果與分析

2.1 核酸質量檢測

2.1.1 紫外吸收檢測 提取的水稻種子DNA通過Neno1000紫外分光光度計測定濃度，均有明顯的OD260檢測峰，OD260/OD280均在1.8~2.1之間，濃度在10~100ng/μ L之間，提取核酸能滿足PCR需求。

2.1.2 內源基因PCR電泳檢測 以水稻內源基因SPS為參照基因對樣品DNA進行擴增，結果如圖1所示，70個樣品均能擴增出明顯的277bp大小條帶，并且陰性對照和陽性對照均正常。

2.1.3 內源基因實時熒光PCR檢測 隨機挑取部分水稻種子樣品對內源基因進行實時熒光PCR檢測，各樣品檢測閾值和Tm值見表2，從結果可知，所有檢測樣品在實時熒光檢測中均有抬頭，檢測閾值在24~30之間，樣品溶解曲線均在同一個位置有高峰，樣品Tm值為88.8。

圖1 樣品SPS基因擴增凝膠電泳分析結果

表2 部分樣品SPS基因EvaGreen熒光檢測閾值和Tm值

2.2 目的基因ATAF1檢測

2.2.1 ATAF1基因PCR電泳檢測 以外源ATAF1基因對樣品DNA進行擴增檢測，結果如圖2所示，70個樣品部分樣品能檢測到明顯的580bp大小條帶，并且陰性對照和陽性對照均正常。

圖2 樣品ATAF1基因擴增凝膠電泳分析結果

2.2.2 ATAF1基因實時熒光PCR檢測 對隨機挑取的部分水稻種子樣品同時進行ATAF1基因實時熒光PCR檢測，從結果可知，所有檢測樣品在實時熒光檢測中均有抬頭，其中部分檢測閾值在16~22之間，部分大于34（表3），樣品溶解曲線均在同一個位置有高峰，樣品Tm值為85.2/84.8。

表3 部分樣品ATAF1基因EvaGreen熒光檢測閾值和Tm值

3 結論與討論

本研究采用磁珠自動提取法大規模地提取水稻種子的DNA，利用紫外分光光度計檢測提取DNA的質量，結果表明大部分提取的DNA濃度（大于10ng/μL）和純度（OD260/OD280在1.8~2.1之間）均滿足一般要求，而部分樣品的濃度和純度未落在上述范圍內，濃度僅有2~3ng/μL，OD260/OD280有的小于1或大于2.5。同時利用內源基因檢測方法檢測提取DNA質量時，這部分樣品DNA均能非常清晰地檢測到內源條帶。因此在PCR擴增檢測中，評價提取DNA的質量不單單僅考慮紫外吸收檢測的結果，同時結合內源基因檢測信息，更好地保證PCR擴增所需DNA的質量。

通過設計外源ATAF1基因引物對研發中的轉基因水稻種子進行普通PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測，初步建立普通PCR篩選檢測轉基因成分的方法。同時挑選部分樣品初步研究實時熒光PCR檢測方法，以EvaGreen作為熒光染料，對內源基因和外源基因進行實時擴增，結果與普通PCR檢測基本一致，在外源基因檢測上，實時熒光PCR具有更高的靈敏度，如表2中Ct值＞34的樣品在實時熒光檢測中能看到擴增曲線有抬頭，但是在普通PCR電泳檢測方法上未能見到條帶，說明這些樣品的轉基因成分含量很低，普通PCR未能檢測到，而用實時熒光PCR方法能檢測較為微量的成分。

[1] 鄧漢超．轉基因植物DNA成分檢測技術研究進展[J]．中國種業，2016（11）：19-21

[2] 侯大軍，李洪軍．轉基因食品的發展歷史與未來趨勢[J]．四川食品與發酵，2007（5）：24-27

[3] 楊銘鐸，張春梅，華慶，等．轉基因食品快速檢測技術的研究進展[J]．食品科學，2004，25（11）：424-427

[4] 葉興國．從轉基因技術角度談轉基因植物的安全性[J]．中國種業，2016（9）：12-13

[5] 陳飛，劉陽，邢福國．轉基因食品的免疫安全性評價[J]．食品科學，2012，33（9）：296-300

[6] 祁瀟哲，黃昆侖．轉基因食品安全評價研究進展[J]．中國農業科技導報，2013，15（4）：14-19

[7] Jiang L X，Yang L T，Zhang H B，et al．International Collaborative Study of the Endogenous Reference Gene，Sucrose Phosphate Synthase（SPS），Used for Qualitative and Quantitative Analysis of Genetically Modified Rice[J]．J Agric Food Chem，2009，57：3525-3532

2017-02-21）

轉基因新品種培育重大專項（2009ZX08001－023B）；深圳市技術創新項目（CXZZ20120614165508810）

劉晉