巨尾桉銅分子伴侶EuCCS基因的克隆及表達分析

趙艷玲, 姚婕

(華僑大學 化工學院， 福建 廈門 361021)

巨尾桉銅分子伴侶EuCCS基因的克隆及表達分析

趙艷玲, 姚婕

(華僑大學 化工學院， 福建 廈門 361021)

以巨尾桉為研究對象，克隆得到巨尾桉銅分子伴侶(CCS)基因(GenBank注冊號為KJ755351.1)，生物信息學分析表明:EuCCS蛋白定位于葉綠體，與龍眼同源基因的一致性達到99%.巨尾桉CCS的原核表達載體pET-EuCCS在大腸桿菌細胞內可以穩定表達，超氧化物歧化酶(SOD)活檢測結果表明:轉化菌株的SOD酶活性比對照菌株高，說明外源基因EuCCS具有生物學活性.利用熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)技術分析CCS在巨尾桉中的表達特性，結果表明：在植株生長旺盛的部位,CCS表達量較大，如植株幼葉，隨植株葉片慢慢衰老，CCS的表達量也隨之下降；在組培苗中，葉片的CCS表達量最大，其次是莖.

巨尾桉; 銅分子伴侶; 克隆; 原核表達; 聚合酶鏈式反應

銅離子是細胞色素氧化酶、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase，Cu/ZnSOD)、漆酶、賴氨酰氧化酶和多巴胺單加氧酶等所必需的輔助因子，在維持植物正常的新陳代謝及生長發育中發揮著重要作用[1].當銅離子超過一定值時，銅離子參與Fenton反應會生成大量的羥自由基，對生物體產生重金屬毒害作用，所以在長期進化過程中，生物體內形成一套完整的銅代謝調控機制，分子伴侶和銅螯合劑調控細胞內和細胞外銅的轉運，達到生物體內銅離子的穩態[2].銅分子伴侶(CCS)可以傳遞銅離子到Cu/ZnSOD中,并將其激活生成有活性的酶分子[3-7].相關研究表明:CCS在調控植物體內銅離子平衡過程中發揮著特殊作用[8-9].本文克隆了巨尾桉的CCS基因，通過初步構建該基因原核表達體系，測定該酶的活性，并通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和實時定量聚合酶鏈式反應(quantitative PCR)技術分析巨尾桉中CCS的表達特性，研究了該基因的基本功能特點.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與植物材料 pET-32a(+)，E.coliJM109，BL21(DE3),巨尾桉植株為本實驗室保存.

1.1.2 試劑 Takara SYBR ExScript等試劑盒和試劑采購自大連Takara公司；引物由廈門精聚公司合成.

1.2 實驗方法

1.2.1 巨尾桉EuCCS基因的克隆方法 具體克隆方法參見文獻[10].PCR引物為CCS1：5′-CATGGCATTTCTGAGGTCGG-3′，CCS2：5′-CTCAGACTTTGCTGGTGAC-3′.CCS目的片段與pMD-18T Vector連接，經聚合酶鏈式反應(PCR)驗證陽性克隆子，命名為pMD-EuCCS，委托華大基因測序.

1.2.2 構建原核表達載體pET-EuCCS并誘導表達 設計引物CSS3:5′CGGATCCATGGCATTTCTGAGGT 3′，CSS4:5′CGAGCTCTCA GACTTTGCTGGTG 3′，獲得亞克隆載體pMD-CCS1，用BamHⅠ 和SacⅠ 雙酶切連接pET-32a(+).用質量分數為12%的SDS-PAGE蛋白電泳分析融合基因在大腸桿菌Bl21中的表達，具體方法參見文獻[10].

1.2.3 IPTG誘導CCS蛋白原核表達條件與SOD酶活性測定 設計兩組實驗，一是加入終濃度分別為0,0.5,1.0,1.5,2.0 mmol·L-1的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，誘導4 h后，SDS-PAGE電泳分析;二是設置16,22,37 ℃搖床中異丙基硫代半乳糖苷誘導4 h的SDS-PAGE電泳分析.采用氮藍四唑(NBT)檢測超氧化物歧化酶(SOD)蛋白酶活，具體方法參見文獻[10].

1.2.4 RT-PCR 和qPCR檢測CCS在巨尾桉不同部位的表達量 巨尾桉葉片及組培苗總核糖核酸(RNA)提取，使用Takara公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser去除基因組DNA，Takara公司的PrimeScript Ⅱ反轉錄反應，利用RT-PCR檢測CCS在桉樹中的表達情況.利用Takara SYBR ExScript 試劑和羅氏LightCycler 480儀器，以桉樹6個樣本的cDNA為模板，內參基因為巨尾桉18S rRNA(171 bp)，引物設計分別為EgCCS1：5′TCATCAAGTCTTGCCTGAGC 3′，EgCCS2：5′GCTCAAGTCCACCTC AACAT 3′，Eg18S1：5′CGCGCTACACTGATGTATTC 3′，Eg18S2：5′GTACAAAGGGCAGGG ACGTA 3′.預變性：95 ℃，30 s;變性：95，℃，5 s;退火：60 ℃，20 s，40個循環，最后延伸，65 ℃，15 s，分析實時定量PCR(qPCR)數據，每個反應包括3個重復.

圖1 RT-PCR擴增巨尾桉CCS基因Fig.1 Amplification products of eucalyptusCCS cDNA sequence

2 研究結果

2.1 巨尾桉CCS基因的克隆

純化采用Trizol法大量提取巨尾桉總RNA獲得信使RNA(mRNA)后，經RT-PCR擴增得到非單一條帶，如圖1所示.圖1中：M為DNA Marker;1～3為cDNA 序列擴增條帶.選擇預測的960 bp左右的條帶為目標條帶切膠回收，克隆得到CCS基因(GenBank注冊號為KJ755351.1).

生物信息學分析(數據未列出)的結果表明:CCS蛋白是定位在葉綠體中的親水的、穩定的酸性蛋白質，該蛋白含2個跨膜螺旋，從N末端朝外由內到外進行跨膜.該蛋白主要由59.6%的無規則卷曲，29.5%的β-折疊和11.0%的α-螺旋等構成，并存在多個磷酸化位點和保守結構域，這些保守結構域的存在可能是激活SOD表達所必須的.采用MEGA 5.2對來自11種不同物種的CCS核酸序列作進化樹分析(數據未列出)，巨尾桉CCS與龍眼、葡萄、蓖麻處于同一分支中，與它們在進化距離上較為接近，同源性分別為99%，81%，80%.

圖2 pET-EuCCS Sac Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切驗證Fig.2 Gel analysis of plasmid pET-EuCCS double digested by Sac Ⅰ/BamH Ⅰ

2.2 原核表達載體pET-EuCCS的構建與誘導表達

亞克隆獲得具有SacⅠ/BamHⅠ酶切位點的pMD-EuCCS與線性載體PET-32a(+)同時雙酶切，凝膠回收之后，連接產物轉化E.coliBL21，SacⅠ/BamHⅠ雙酶切篩選陽性質粒，命名為pET-EuCCS.

pET-EuCCSSacⅠ/BamHⅠ雙酶切驗證，如圖2所示.圖2中：M為DNA Marker;1～3為pET-EuCCSSacⅠ/BamHⅠ雙酶切條帶.

圖3 重組CCS在E. coli BL21中表達的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression of recombinant pET-EuCCS in E. coli BL21

pET-32a(+)載體的N端部分分子量大約為18 ku，基因完整閱讀框為960 bp，編碼320個氨基酸，理論上可表達32 ku大小，加上表達系統的融合蛋白部分，預期融合蛋白大小是50 ku.經IPTG誘導之后，重組質粒表達一條大約50 ku條帶，如圖3所示.這與預期的表達目標蛋白一致.圖3中：M為蛋白Marker;1為未誘導的空菌株;2為誘導的空菌株;3為未誘導的含pET-32a(+)的菌株;4為誘導的含pET-32a(+)的轉化菌株;5為未誘導的含pET-EuCCS的轉化菌株;6為誘導的含pET-EuCCS的轉化菌株；箭頭所示為表達的融合蛋白條帶位置.

2.3 CCS蛋白原核表達條件的初步研究

在不同濃度IPTG誘導CCS蛋白表達實驗中，IPTG添加量為0.5 mmol·L-1時，足以誘導CCS蛋白表達，如圖4所示.圖4中：M為蛋白Marker;1～5分別為0,0.5,1.0,1.5,2.0 mmol·L-1誘導4 h的蛋白表達；箭頭所示為表達的融合蛋白條帶.16,22,37 ℃ 的IPTG誘導含pET-EuCCS菌株都能正常表達出CCS蛋白，如圖5所示.圖5中：M為蛋白 Marker;1為16 ℃ IPTG誘導pET-32a;2為16 ℃ IPTG誘導pET-EuCCS;3為22 ℃ IPTG誘導pET-32a；4為22 ℃ IPTG誘導pET-EuCCS;5為37℃ IPTG pET-32a；6為37 ℃IPTG誘導pET-EuCCS.為了檢測最佳的IPTG誘導時間，對16,22,37 ℃下的IPTG誘導時間進行研究.結果表明：16 ℃誘導下，9 h后，CCS蛋白表達量趨于穩定；22 ℃誘導下，6 h后，CCS蛋白表達到最大量；37 ℃誘導下，4 h后，CCS蛋白表達趨于穩定(數據未列出).

圖4 不同濃度IPTG誘導對EuCCS蛋白表達的影響 圖5 不同溫度IPTG誘導對CCS蛋白表達的影響Fig.4 Effect of IPTG concentration on expression of recombinant EuCCS protein expression Fig.5 Effect of IPTG temperature on expression of CCS protein expression

圖6 不同溫度誘導菌株的SOD酶活檢測Fig.6 SOD enzyme activity detection under different induction temperatures

CCS的酶活性無法直接檢測，可以通過檢測CCS底物Cu/ZnSOD酶活來間接檢測CCS的活性.為了檢測外源基因CCS誘導表達的蛋白是否具有生物學活性，利用氮藍四唑法檢測不同溫度誘導菌株的SOD酶活，如圖6所示.圖6中：z為酶活；t為溫度.由圖6可知：在16，22 ℃ IPTG誘導下，轉化菌株pET-EuCCS的SOD酶活性高于對照菌株pET-32a，說明EuCCS的表達可以提高大腸桿菌Cu/ZnSOD的活性；在37 ℃誘導下，SOD酶活變化不大，可能是由于表達蛋白在此溫度下形成包涵體所致，包涵體中的蛋白無酶活性.

2.4 巨尾桉CCS的表達分析

巨尾桉CCS基因在組培苗根、莖、葉和植株幼葉、中段葉和老葉均有表達，如圖7所示.由圖7可知：組培苗葉片中的CCS表達量比根、莖更大，植株中幼葉的CCS表達量最大，之后是成熟葉和老葉.

(a) 溫室苗的不同齡葉片 (b) 組培苗的不同部位圖7 RT-PCR檢測巨尾桉不同部位的CCS表達情況Fig.7 RT-PCR detection of CCS expression in eucalyptus

利用實時定量 PCR方法進行基因表達解析，選擇18S RNA作為參比基因來對所有樣品進行歸一化處理，再對不同樣品之間的目的基因表達量進行比較.用目的基因CCS的定量結果除以管家基因18S的定量結果得到校正值.實時定量PCR分析巨尾桉CCS基因表達，如圖8所示.由圖8(a)可知：用目的基因CCS校正值作柱狀圖，巨尾桉組培苗葉和莖中的CCS表達量較高，而根中的表達量相對較低.由圖8(b)可知：巨尾桉溫室苗幼葉中的CCS表達量最高，其次是成熟葉，衰老葉片中檢測不到CCS的表達，可能是由于表達量太小所致，這個結果和RT-PCR的結果基本一致.

(a) 組培苗 (b) 溫室苗圖8 實時定量PCR分析巨尾桉CCS基因表達Fig.8 Quantitative PCR analysis of CCS relative expression in eucalyptus

3 討論

CCS基因的功能研究的方法主要是原核表達和真核表達研究.擬南芥的CCS基因轉入酵母表達體系中發現，擬南芥CCS可以激活酵母細胞中Cu/ZnSOD的表達[11]，大豆的CCS基因，構建原核表達載體后轉化到大腸桿菌中，也具有表達活性[6].文中巨尾桉CCS基因可以穩定地在大腸桿菌中表達，在37,22,16 ℃條件下，1 mmol·L-1IPTG誘導到4,6,12 h，可達到穩定.通過SOD酶活測定 22,16 ℃誘導下，轉化菌株酶活比對照組明顯升高，說明該溫度下獲得的EuCCS表達產物可以提高大腸桿菌的Cu/ZnSOD活性.

研究者已經對馬鈴薯、擬南芥等的CCS的表達特性進行了研究.在CCS表達部位的研究有將馬鈴薯的CCS啟動子區域融合熒光素酶序列，轉基因發現在馬鈴薯莖塊和匍匐枝中CCS基因表達量最大，在根部和花部的表達量最小[4].擬南芥全長CCS基因融合綠色熒光蛋白基因的表達載體轉入擬南芥后熒光蛋白集中在葉綠體內.這表明克隆得到的擬南芥CCS主要定位于葉綠體內[11].利用RT-PCR和qPCR技術研究巨尾桉的CCS基因發現，在植株生長旺盛的部位CCS表達量較大，如植株幼葉，隨植株葉片慢慢衰老，CCS的表達量也隨之下降；巨尾桉組培苗中葉片中CCS的表達量最大，其次是莖和根，與該基因可能定位于葉綠體表達的研究結果相呼應.

4 結束語

CCS與逆境相關的表達特性主要體現為：環境中銅離子過量時，擬南芥莖和根中CCS的表達量上升，反之則下降[12].馬鈴薯的CCS啟動子區域包含幾個同源的順式作用因子，其中有3個和植物生長素響應有關，4個和應激響應有關.CCS可以被植物生長素、赤霉素、果糖、蔗糖、葡糖糖誘導表達，高濃度的銅離子則抑制表達[4].植物在衰老狀態下，CCS的表達量也會隨之增加[13].CCS是一個與逆境相關的基因，調控CCS的表達可能會提高植物的耐受逆境的能力，下一步的工作是把基因轉入到植物中，研究基因的功能和調控機理，定向培育高抗植物.

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(責任編輯： 錢筠 英文審校： 劉源崗)

Cloning and Expression of Copper Chaperone or Superoxide Dismutase Gene inEucalyptusgrandis×E.ophylla

ZHAO Yanling, YAO Jie

(College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China)

The major pathway for activation ofCu/ZnSODrequires the CCS copper chaperone to insert copper and activateCu/ZnSODthrough oxidation of an intramolecular disulfide. TheEuCCSgene is cloned by RT-PCR fromEucalyptusgrandis×E.ophylla(GenBank Accession Number: KJ755351.1).Boinformatics analysis suggests that CCS is located in the chloroplast and the evolutionary distance between eucalyptus and longan is quite close with the identity of 99%.The strain prokaryotic expression vector pET-EuCCScan be expressed stably inE.coli, and the superoxide dismutase enzyme activityis higher than control indicating that the clonedEuCCSgene could activateCu/ZnSOD.Besides, the expression characteristics of eucalyptus CCS gene are analyzed by quantitative PCR.And the results show that theEuCCSquantity of the young leaves is relatively higher than that of the old one to greenhouse seedling and for tissue culture seedling theEuCCSis expressed higher in leaves than stem and root. Keywords：Eucalyptusgrandis×E.ophylla; copper chaperone for superoxide dismutase; clone; prokaryotic expression; polymerase chain reaction

2016-05-18

趙艷玲(1978-)，女，助理研究員，博士，主要從事植物分子生物學的研究.E-mail:zhaoyl@hqu.edu.cn.

國家自然科學基金資助項目(31300497)

Q 943.2

A

1000-5013(2017)03-0374-05