肉桂雙瓣卷蛾為害對樟樹葉片揮發物的影響

邱華龍，趙丹陽，莫 羨，徐金柱，揭育澤，秦長生*

(1. 廣東省林業科學研究院，廣東省森林培育與保護利用重點實驗室，廣州 510520；2. 中山市林業有害生物防治檢疫站，廣東中山 528400)

肉桂雙瓣卷蛾為害對樟樹葉片揮發物的影響

邱華龍1，趙丹陽1，莫 羨2，徐金柱1，揭育澤1，秦長生1*

(1. 廣東省林業科學研究院，廣東省森林培育與保護利用重點實驗室，廣州 510520；2. 中山市林業有害生物防治檢疫站，廣東中山 528400)

采用頂空固相微萃取(SPME)及氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)技術分析肉桂雙瓣卷蛾為害前后的樟樹葉片揮發物變化。結果表明，健康和蟲傷的樟樹葉片中均含有26種相同的揮發物成份，但是肉桂雙瓣卷蛾為害后揮發物的相對含量發生顯著變化。肉桂雙瓣卷蛾危害后，葉片中的黃樟素含量顯著增高，健康葉片中黃樟素僅占0.6%，而蟲傷葉片中為2.7%；但是反-水合倍半香檜烯、順-橙花叔醇、反-橙花叔醇及α-紅沒藥烯含量均顯著降低，健康葉中分別含1.9%、4.5%、11.6%和1.2%，而蟲傷葉片中分別占0.6%、2.1%、7.0%和0.7%。揮發物組分含量變化可能在調控害蟲取食、天敵對獵物的搜尋等行為過程中發揮作用。本研究為探索植物揮發物對害蟲及天敵行為的影響奠定基礎，為了解寄主-昆蟲-天敵三層營養關系的相互作用、利用天然活性化合物防治害蟲提供理論依據。

肉桂雙瓣卷蛾；葉片；頂空固相微萃取；氣象色譜-質譜；揮發物

肉桂雙瓣卷蛾Polylophacassiicola隸屬于鱗翅目Lepidoptera卷蛾科Tortricidae，主要寄主為肉桂Cinnamomumcassia、樟樹C.camphora和黃樟C.Porrecium(彭石冰等，1992)。該蟲以幼蟲鉆食寄主植物的嫩梢，造成新梢大量死亡，主梢不斷枯死，側梢叢生(圖1)。肉桂雙瓣卷蛾在我國1年發生6-7代，第1代幼蟲于5月下旬開始出現，第2-4代世代重疊明顯，每個世代約30 d(趙丹陽等，2016)。該蟲具趨嫩產卵習性，只選擇在新抽嫩梢上產卵，嫩梢長達2 cm以上時是其大量產卵危害期。成蟲產卵于樟樹葉背面，5-8 d后卵孵化為幼蟲，初孵幼蟲沿葉柄爬至嫩梢、嫩葉，從嫩葉主脈或芽頂直接鉆蛀入髓心為害(圖1a)，4-5 d后葉芽出現枯萎狀(圖1b)，此時為1齡幼蟲；2齡幼蟲蛀入嫩梢為害，當蛀道達2 cm左右時嫩梢有萎蔫狀變化；3齡幼蟲大量取食，蛀道約4-7 cm，梢部完全枯萎(圖1c)；老熟幼蟲掉頭回到嫩梢上方咬1小孔吐絲下垂落地，尋找合適的地方化蛹(鄭寶榮，2007)。

目前在農林生產上主要是利用化學藥劑防治肉桂雙瓣卷蛾，而尚未有利用寄主植物釋放的化學信息素監測和防治肉桂雙瓣卷蛾的相關報道。植物產生并釋放的揮發性物質是形成植物氣味特征的主體，其組成成分與比例構成了該種植物的化學指紋圖(Dicke, 2016)。這些氣味物質調控著昆蟲的多種行為，諸如寄主定向、產卵、逃避、取食、聚集和傳粉等(劉芳等，2003；郭祥令等，2011)。因此，研究這些物質，對于研究植物揮發物對昆蟲行為的影響有著非常重要的意義，可以探索昆蟲各種行為的內在機理，更好地了解寄主-昆蟲-天敵三層營養關系的相互作用，為利用天然活性化合物防治害蟲及生物防治提供理論依據。目前植物揮發物提取的方法主要有溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、抽氣吸附法、動態頂空采集法和固相微萃取法(SPME)。其中SPME具有無需有機溶劑、靈敏度高、操作簡單、重現性好、防止二次污染等優點，集采樣、萃取、濃縮、進樣、分析于一體，可以直接與氣相色譜或液相色譜相聯(孫凡等，2008)。文中采用SPME技術對健康及肉桂雙瓣卷蛾為害的剛抽出的樟樹嫩葉的揮發物進行了采集和分析，然后采用氣譜質譜聯用技術對其揮發物進行分離與鑒定，以期為肉桂雙瓣卷蛾的監測和防治提供理論依據。

圖1 肉桂雙瓣卷蛾為害樟樹狀Fig.1 Cinnamum camphora was damaged by larvae of Polylopha cassiicola注：a，肉桂雙瓣卷蛾幼蟲；b，肉桂雙瓣卷蛾危害后初期癥狀；c，肉桂雙瓣卷蛾危害后后期癥狀。Note: a, Larva of Polylopha cassiicola; (b), Damage symptom of P. cassiicola at early satge;c, Damage symptom of P. cassiicola at late satge.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試植物為樟樹新抽嫩梢上的嫩葉，實驗樣品采自廣州市天河區廣東林科院苗圃內。采集剛受肉桂雙瓣卷蛾為害的嫩梢上的新鮮葉片，設為蟲傷組；采集健康無損的嫩梢葉作為健康對照組，每組各重復4次。

1.2 試驗方法

實驗儀器為頂空固相微萃取裝置收集揮發物，固相微萃取采用PDMS(100 μm)涂層的萃取頭(Supelco公司，美國)。將剛采集的健康和蟲傷的2-3個嫩梢(每個嫩梢含3-6片嫩葉，每片嫩葉長約1-2 cm)放入15 mL樣品瓶中，瓶蓋上還有硅膠隔墊，將萃取頭從隔墊插入瓶中，伸出萃取頭，使萃取頭在葉片的正上方，然后置于恒溫培養箱中，35℃條件下萃取40 min，將收集的揮發物用于后續分析。

利用島津氣象色譜-質譜聯用儀(GC-MS，島津QP2010 Ultra)對收集到的揮發物進行分析。色譜柱為島津SH-RXI-5SIL MS毛細管柱(30 m × 0.25 μm × 0.25 mm)，載氣為99. 99%高純氦氣，流速1.2 mL/min。進樣口溫度250℃，質譜采用EI電離方式，離子源溫度250℃，四級桿溫度150℃，接口溫度280℃。柱升溫程序為初始溫度40℃保留3 min，以5℃/min升至200℃，再以30℃/min升至250℃，保留4 min。采用不分流進樣，溶劑延遲3 min。

1.3 數據分析

利用島津GC-MS工作站(GC-MS solution 2.7)對揮發物的離子譜圖的峰進行定性和相對定量分析。采用SIMCA-P Version 15軟件包(Umetrics Umea, Sweden)對數據進行分析。將每個揮發性化合物峰的相對百分含量進行反正弦轉換，用于主成分PCA建模分析。利用SPSS(V22, IBM)軟件一般線性模型(General linear model: GLM)中的多元方差分析(SPSS-MANOVA)檢驗蟲傷和健康葉片揮發性化合物的物質及含量差異。利用R(Version 3.3.1)軟件中的vegan軟件包進行聚類和變量之間的相關性分析。

2 結果與分析

健康葉片和蟲傷葉片的揮發性物質的GC-MS總離子流圖如圖2所示。通過NIST譜庫檢索，從健康葉片和蟲傷葉片的離子色譜圖中均鑒定出26種揮發性物質(表1)。健康葉片中，含量最高的前5種揮發物為異丁香烯、反-橙花叔醇、β-芹子烯、(反)3,7-二甲基-3,6-辛二烯醛和芳樟醇。

圖2 健康葉片和蟲傷葉片揮發物的GC-MS總離子流圖Fig.2 Gas-chromatogram of volatiles of normal and insect damaged leaves

編號Number出峰時間Retentiontime化合物名稱CompoundnameCAS號CASNumber相對百分含量(%)Relativecontent健康葉Healthy蟲傷葉InsectdamagedP值Pvalue11267反?β?羅勒烯Beta?trans?Ocimene3779?61?119±0716±09053621301順?β?羅勒烯Bbeta?cis?Ocimene3338?55?442±1236±19049131475芳樟醇Linalool78?70?659±1579±24028141659(順)3，7?二甲基?3，6?辛二烯醛Isoneral106?26?321±0219±0404751722(反)3，7?二甲基?3，6?辛二烯醛Isogeranial1754?00?374±1179±41081261783異環檸檬醛 2，4，6?Trimethyl?4?cyclohexene?1?carboxaldehyde1335?66?626±1116±06008771840順馬鞭草烯醇Cis?Verbenol1845?30?316±0409±05009681884順式檸檬醛Neral5392?40?514±0308±04015592026黃樟素Safrole94?59?706±0327±220042?102268蒎烯Copaene3856?25?516±0119±160954112353異丁香烯Isocaryophyllene118?65?013±2816±230117122383石竹烯Caryophyllene87?44?510±0515±090526132437雙環吉馬烯Beta?Cyclogermacrane37839?63?723±1013±0500951424674?(1，5?二甲基?1，4?己二烯基)?1?甲基環己烯4?[(1E)?1，5?Dimethyl?1，4?hexadienyl]?1?methyl?1?cyclohexene29837?07?813±0708±0304941524831，5，9，9四?甲基?1，4，7環?十一碳三烯1，5，9，9?Tetramethyl?1，4，7?cycloundecatriene不詳Unknow83±00478±310583162516gamma?姜黃烯Gamma?Curcumene451?55?815±0209±04014172528衣蘭烯Ylangene14912?44?819±0311±090203182571β?芹子烯Beta?Selinene17066?67?0103±08105±080692192585α?芹子烯Alpha?Selinene473?13?249±0548±010728202626反?水合倍半香檜烯Cis?Sesquisabinene119238?96?919±0606±020005?212660順?橙花叔醇Nerolidol7212?44?445±1021±060005?222742反?橙花叔醇E?Nerolidol40716?66?3116±2170±24004?232778α?紅沒藥烯Alpha?Bisabolene495?62?512±0407±020039?242815(E)?beta?金合歡烯 (E)?beta??Famesene18794?84?817±0506±030065253020庚?2?基酯外型3?甲基丁酸?1，7，7?三甲基二環[221]庚?2?基酯3?Methyl?but?2?enoicacid，1，7，7?trimethyl?bicyclo[221]hept?2?ylester不詳Unknow12±0408±0603032631133?甲基?2?丁烯酸苯酯3?Methyl?2?butenoicacid，tridec?2?ynylester不詳Unknow34±2228±150639

注：相對百分含量為平均值±標準差；P值是健康和蟲傷葉片間的差異顯著性，P≤0.05表明差異顯著。Note: The relative contents of volatiles were indicated by means ± SD;Pvalues represent the level of difference of each volatile between normal and insect damaged leaves,P≤0.05 means significant difference.

多元方差分析結果表明，蟲傷葉片和健康葉片之間的揮發物區別較明顯，接近顯著性水平(Pillai’s Trace=0.999，F1, 6=187.64，P=0.056)。單變量組間比較結果表明，蟲傷葉片和健康葉片之間的黃樟素、反-水合倍半香檜烯、順-橙花叔醇、反-橙花叔醇和α-紅沒藥烯相對含量具有顯著差異(P≤0.05，P值分別為0.042，0.005，0.005，0.04和0.039)(表1)。

通過主成分分析對健康葉片和蟲傷葉片的揮發性物質進行二維和三維PCA建模分析，表明蟲傷葉片和健康葉片樣本可以在得分圖中明顯區分開來，并且三個主成分對模型的解釋率分別為RX[1]=39.8%、RX[2]=22.4%和RX[3]=18.3%，累積的解釋率R2Xcum=80.4%(圖3a, b)。Cluster聚類分析表明，所有對照樣本均聚為一支，蟲傷葉片三個樣本(T1-T3)聚為一支，而樣本4(T4)單獨為一分支(圖3c)。

圖3 主成分和聚類分析比較蟲傷和健康葉片的揮發物差異Fig.3 Analysis of volatiles between normal and insect damaged leaves with PCA and cluster methods注：a,二維PCA得分圖;b,三維PCA得分圖模型，其中黑色代表健康葉片，紅色代表蟲傷葉片；c,健康(CK-CK4)和蟲傷(T1-T4)葉片樣本聚類分析圖。Note: a, 2-D scores plot;b, 3-D scatter plot of PCA model, in which black and red symbles represent normal and insect damaged leaves, respectively； c, cluster plot of four normal leaves samples(CK1-CK4) and four insect damaged leaves samples (T1-T4).

3 結論與討論

本研究結果表明，樟樹嫩葉受肉桂雙瓣卷蛾幼蟲為害后，葉片中的揮發物的相對含量發生變化，其中黃樟素的含量顯著升高。據研究報道，植物在遭受植食性昆蟲或病原菌危害時，揮發物組分的質和量會發生改變，從而影響害蟲和媒介昆蟲取食、天敵對寄主或獵物的搜尋等行為(Cusumanoetal., 2015；楊玉枝等，2015)。害蟲取食寄主植物葉片后，誘導植物釋放揮發性化合物驅避其它植食性昆蟲。其它昆蟲通過感應寄主植物揮發物含量變化而得知植物上已存在競爭者、食物質量降低或植物已啟動化學防御等而遠離受害植物(Dicke, 2016)。例如，經過斜紋夜蛾Spodopteralittoralis取食誘導的水稻揮發物對褐飛虱具有明顯的拒避效果(Xuetal., 2002)；菜粉蝶Pierisrapae更喜歡在健康且未受其它昆蟲取食為害的寄主植物上產下后代(嚴善春等，2007)。此外，研究報道捕食性天敵和寄生性天敵在和害蟲的協同進化過程中，可以利用害蟲或其寄主植物釋放的化學信號物質對獵物進行遠距離定位(Steinbergetal., 1993)。比如，小黑瓢蟲Delphastuscatalinae對健康、機械損傷、煙粉虱卵危害和煙粉虱若蟲危害的花菜植株所產生的揮發性物質選擇性實驗表明，蟲害誘導后，花菜植株的揮發物對小黑瓢蟲的引誘效果顯著增強(徐桂萍，2011)。因此，推測樟樹被肉桂雙瓣卷蛾為害后，可能通過釋放黃樟素驅避其它害蟲繼續為害，或者引誘天敵如螟黃赤眼蜂Trichogrammachilonis控制肉桂雙瓣卷蛾的種群數量。然而，在植物和昆蟲的協同進化中，有些蟲害誘導的植物揮發物可以讓害蟲受益。例如三葉楊葉甲Chrysomelapopuli(Kendrick and Raffa, 2006)和白楊葉甲Chrysomelapopuli(Brillietal., 2009)取食誘導的植物揮發物均對同種昆蟲具有較強的引誘作用。因此，受肉桂雙瓣卷蛾為害后，黃樟素含量升高，其具體的生態功能還有待于進一步研究。

在本研究中，反-水合倍半香檜烯、順-橙花叔醇、反-橙花叔醇及α-紅沒藥烯受肉桂雙瓣卷蛾為害后相對含量均顯著降低，推測可能是嫩葉受蟲害后，光合作用及代謝能力減弱，影響物質的合成和釋放。研究報道寄主植物受害蟲危害后，將更多的能量用于自身的免疫防御從而減少揮發物的合成和釋放(Kaloshian and Walling, 2016)。此外，研究報道蟲口密度和危害時間等因素會影響寄主植物揮發物的釋放，茶麗紋象甲Myllocerinusaurolineatus、假眼小綠葉蟬Empoascavitis、茶尺蠖Ectropisobliquehypulina危害誘導茶樹產生的吲哚在達到釋放頂峰后，其釋放量會隨著危害時間的延長而逐步減少(蔡曉明，2009)。由于樟樹葉片揮發物的組分種類較多，這些揮發物釋放時空動態節律、對肉桂雙瓣卷蛾的作用方式及各組分之間的相互協同作用等問題還需要深入研究，才有可能將這些植物揮發物更好地應用于肉桂雙瓣卷蛾的生物防治中。

References)

Brilli F, Ciccioli P, Frattoni M,etal. Constitutive and herbivore-induced monoterpenes emitted byPopuluseuroamericanaleaves are key volatiles that orientChrysomelapopulibeetles [J].PlantCell&Environment, 2009, 32 (5): 542-552.

Cai JM. The Emission of Tea Plant Volatiles Induced by Three Herbivore Insect Pests [D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2009. [蔡曉明. 三種茶樹害蟲誘導茶樹揮發物的釋放規律[D]. 中國農業科學院, 2009]

Cusumano A, Weldegergis BT, Colazza S,etal. Attraction of egg-killing parasitoids toward induced plant volatiles in a multi-herbivore context [J].Oecologia, 2015, 179 (1): 163-174.

Dicke M. Induced plant volatiles:Plant body odours structuring ecological networks [J].NewPhytologist, 2016, 210 (1): 10-12.

Guo XL, He YR, Wang DS,etal. Behavioral responses ofTrichogrammatoideabactraeto volatiles of cruciferous vegetables [J].JournalofEnvironmentalEntomology, 2011, 33 (1): 74-80. [郭祥令, 何余容, 王德森,等. 卷蛾分索赤眼蜂對十字花科蔬菜揮發性物質的行為反應[J]. 環境昆蟲學報, 2011, 33 (1): 74-80]

Kaloshian I, Walling LL. Plant immunity:Connecting the dots between microbial and hemipteran immune responses [J].ManagementofInsectPeststoAgriculture, 2016: 217-243.

Kendrick AP, Raffa KF. Sources of insect and plant volatiles attractive to cottonwood leaf beetles feeding on hybrid poplar [J].JournalofChemicalEcology, 2006, 32 (12): 2585-94.

Liu F, Lou YG, Cheng JA. Herbivory insect induced plant volatiles:Evolutionary products of plant-herbivore-natural enemy interactions [J].EntomologicalKnowledge, 2003, 40 (6): 481-486. [劉芳, 婁永根, 程家安. 蟲害誘導的植物揮發物:植物與植食性昆蟲及其天敵相互作用的進化產物[J]. 昆蟲知識, 2003, 40 (6): 481-486]

Peng SB, Jiang ZS, Li JQ,etal. Study on the biology and control ofCophoprorasp. inCinnamomumcassia[J].ForestResearch, 1992,1: 82-88. [彭石冰, 江祖森, 李錦權, 等. 肉桂雙瓣卷蛾生物學特性及防治研究[J]. 林業科學研究, 1992,1: 82-88]

Steinberg S, Dicke M, Vet LEM. Relative importance of infochemicals from first and second trophic level in long-range host location by the larval parasitoidCotesiaglomerata[J].JournalofChemicalEcology, 1993, 19 (1):47-59.

Sun F, Ru JH, Li R,etal. Analysis of volatile component ofUlmuspumilaby solid phase microextraction coupled with GC-MS [J].JournalofNortheastAgriculturalUniversity, 2008, 36 (5): 55-57. [孫凡, 魯繼紅, 李壘, 等. 采用固相微萃取-氣譜質譜聯用技術分析家榆揮發物組成成分[J]. 東北林業大學學報, 2008, 36 (5): 55-57]

Xu GP. Attacting Effect of Host Plants Volatiles ofBemisiatabacionDelphastuscatalinae[D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2011. [徐桂萍. 煙粉虱寄主植物揮發物對小黑瓢蟲引誘作用的研究[D]. 福建農林大學, 2011]

Xu T, Zhou Q, Xia Q, Zetal. Effects of herbivore-induced rice volatiles on the host selection behavior of brown plant hoppe,Nilaparvatalugerts[J].ChineseScienceBulletin, 2002, 47 (11): 1355-1360.

Yan SC, Xu W, Yuan HE,etal. Effects of differente licitors on olfactory response and oviposition selection ofDendrolimussuperans(Butler) [J].ChineseJournalofAppliedEcology, 2007, 18 (7): 1583-1588. [嚴善春, 徐偉, 袁紅娥, 等. 不同誘導因子對落葉松毛蟲嗅覺和產卵選擇的影響[J]. 應用生態學報, 2007, 18 (7): 1583-1588]

Yang YZ, Xu D, Cen YJ. Analysis of volatile compounds from young shoots of non-infected and huanglongbing-infected citrus [J].JournalofEnvironmentalEntomology, 2015, 37 (2): 328-333. [楊玉枝, 徐迪, 岑伊靜. 健康和感染黃龍病沙糖桔嫩梢揮發性成分的分析[J]. 環境昆蟲學報, 2015, 37 (2): 328-333]

Zhao DY, Qin CS, Liao FY,etal. Damages ofPolylophacassiicolaonCinnamomumcamphoraand its chemical control [J].JournalofShanghaiJiaotongUniversity(Agricultural Science), 2016, 34 (4): 36-40. [趙丹陽, 秦長生, 廖仿炎, 等. 樟樹上肉桂雙瓣卷蛾發生危害及藥劑防治[J]. 上海交通大學學報(農業科學版), 2016, 34 (4): 36-40]

Zheng BR. Study on population dynamics and integrated control ofPolylophacassiicolainCinnamomumcassia[J].JournalofFujianForestryScienceandTechnology, 2007, 34 (2): 10-13. [鄭寶榮. 肉桂雙瓣卷蛾種群動態及綜合治理研究[J]. 福建林業科技, 2007, 34 (2): 10-13]

The impact ofPolylophacassiicoladamage on the volatiles ofCinnamomumcamphoraleaves

QIU Hua-Long1, ZHAO Dan-Yang1, MO Xian2, XU Jin-Zhu1, JIE Yu-Ze1, QIN Chang-Sheng1*

(1. Guangdong Academy of Forestry, Guangdong Provincial Key Laboratory of Silviculture, Protection and Utilization, Guangzhou 510520, China; 2. Forest Disease and Insect Control and Quarantine Station of Zhongshan City, Zhongshan 528400, Guangdong Province, China)

Headspace solid phase micro extraction (SPME) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) technology were used to campare volatiles between normal andPolylophacassiicoladamaged leaves ofCinnamomumcamphora. Results showed that normal andP.cassiicolainjured leaves contained the same 26 volatiles, but relatively content of some volatiles were altered afterP.cassiicoladamage. Specifically, the content of safrole was significantly increased after insect damage. The relative content of safrole was only 0.6% in normal leaves, while it was increased up to 2.7% inP.cassiicoladamaged leaves. Neverrtheless, the relative contents of cis-Sesquisabinene hydrate, cis-nerolidol, anti-nerolidol and α-bisabolene were significantly reduced afterP.cassiicoladamage, they were decreased from 1.9%, 4.5%, 11.6% and 1.2% in normal leaves to 0.6%, 2.1%, 7.0% and 0.7% inP.cassiicoladamaged leaves, respectively. The alteration of content of volatiles might play a key role in regulating the insect feeding and prey searching behavior of natural enemy. This study lay the foundation for exploring the impact of plant volatiles on the behaviour of insect pests and their natural enemy, providing theoretical basis for understanding the three trophic relationships interaction among host plant, insect pest and natural enemy, as well as the use of natural active compounds for the control of insect pests.

Polylophacassiicola; leaf; SPME; GC-MS; volatile

廣東省林業科技創新專項(2013KJCX015-4，2015KJCX044)

邱華龍，男，1988年生，助理研究員，從事林業有害生物防治技術研究，E-mail: qiuhualong2008@163.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: 919824595@qq.com

Received: 2016-10-24；接受日期Accepted: 2017-01-12

Q968.1;S433.4

A

1674-0858(2017)02-0464-07

邱華龍，趙丹陽，莫羨,等.肉桂雙瓣卷蛾為害對樟樹葉片揮發物的影響[J].環境昆蟲學報，2017,39(2):464-470.