基于微孔過濾板的蛋白吸附高通量篩選方法

褚文寧，林東強，姚善涇

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基于微孔過濾板的蛋白吸附高通量篩選方法

褚文寧，林東強，姚善涇

（浙江大學化學工程與生物工程學院，生物質化工教育部重點實驗室，浙江杭州 310027）

針對色譜分離過程優化，建立了基于微孔過濾板的蛋白吸附高通量篩選方法，用于介質初篩、吸附性能考察、吸附等溫線和吸附動力學測定、吸附和洗脫條件優化等。首先優化了96孔過濾板的操作參數，以2種離子交換介質和2種混合模式介質為典型代表，采用微孔過濾板方法考察了不同介質和液相條件下牛血清白蛋白的吸附，得到結合載量分布圖，確定了合適的蛋白吸附和解吸條件。進一步測定了4種介質在特定吸附條件下的吸附等溫線和吸附動力學曲線，獲得吸附相關參數。最后，采用微孔過濾板進行了洗脫條件優化，并與填充柱色譜分離進行比較，驗證了方法的可靠性。結果表明，基于微孔過濾板的蛋白吸附高通量篩選是切實可行的，可以快速篩選色譜介質和液相，優化蛋白分離條件，具有資源消耗小、實驗通量大、研發周期短、適用性廣、穩定性高的特點，是蛋白色譜分離過程優化的一種新方法。

高通量篩選；微孔過濾板；色譜分離；吸附；蛋白分離

引 言

目前生物制品的質量要求不斷提高，研發難度和成本不斷增加[1]。鑒于生物對象的特殊性和復雜性，制備過程的優化通常比較繁雜，涉及因素很多，往往難以系統優化，尋求高效、簡便、快速的過程開發方法成為當前的研究熱點[2]。引入高通量過程開發（high-throughput process development, HTPD）理念，提高過程通量，可以達到事半功倍的效果，已應用于菌種篩選[3-5]、培養過程優化[6-8]和下游純化工藝開發[9-12]。應用于色譜分離的HTPD主要采用DoE、演化算法或數學模型等設計手段，利用手動或者自動系統進行高通量實驗，基于數據分析評價實驗結果，優化分離條件[13-14]。Rege等[15]應用HTPD進行重組-淀粉酶色譜分離的介質篩選和條件優化，直接轉化到較大規模的蛋白純化。Nfor等[16]采用HTPD評價4種混合模式介質和6種蛋白的吸附等溫線，為蛋白分離純化提供指導。Bergander等[17]采用HTPD研究多克隆人IgG和親和介質MabSelect SuRe間的吸附動力學和動態結合載量。結果表明，引入HTPD有效減少了試劑用量，增大了過程通量，提高了研發效率，達到快速確定色譜分離工藝的目的。

HTPD應用于色譜過程開發主要有3種模式，微孔過濾板、微量移液色譜柱和微升填充柱，具體見圖1。不同模式在操作方法和使用范圍等方面有較大差別，微孔過濾板的介質量為2～50ml，靈活性高，便于改變介質種類和添加量；微量移液色譜柱的介質量為5～320ml，微升填充柱的介質量為50～200ml，一般只能使用預裝柱。微孔過濾板屬于分批加樣操作，實驗通量大，可手動操作，適合大量條件的篩選；微量移液色譜柱和微升填充柱類似于固定床操作，一般采用自動加液系統，適合考察上樣量和洗脫條件，優化色譜分離[18]。相比較而言，微孔過濾板模式最為通用，適用范圍廣，且無需自動加液平臺，關鍵是必須合理設計流程，優化各項參數，盡量減少微量操作造成的誤差，才能達到常規色譜分離一致的結果。

離子交換色譜是應用最廣泛的色譜分離方法，而混合模式色譜是近年來迅速發展的新型蛋白分離技術[19-26]。本文將基于微孔過濾板法，以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為模型蛋白，2種離子交換介質（Q Sepharose FF和SP Sepharose FF）和2種混合模式介質（Capto adhere和Capto MMC）為典型代表，探討HTPD用于色譜分離過程開發的全過程，包括介質初步篩選、吸附性能考察、吸附等溫線和吸附動力學測定、柱吸附和洗脫條件優化，優化實驗條件，確定評價方式，建立一套快速優化色譜分離過程的方法，為蛋白色譜分離工藝的開發提供新方法。

1 材料和方法

1.1 主要材料與儀器

色譜介質：Q Sepharose FF、SP Sepharose FF、Capto adhere和Capto MMC，購自GE Healthcare公司，配基結構見圖2。牛血清白蛋白（等電點4.7，分子量66700）：生工生物工程有限責任公司；MultiScreen HTS BV型96孔過濾板和MSVMHTS00真空多聯裝置：默克密理博公司；恒溫振蕩儀：賽默飛世爾科技公司；AKTA explorer 100色譜分離系統和Tricorn 5/50色譜柱（內徑5 mm，柱長50 mm）：GE Healthcare公司；OneDrop OD-1000+分光光度計：南京五義科技有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 微孔過濾板HTPD流程

微孔過濾板HTPD系統主要由96孔過濾板、恒溫振蕩儀、真空多聯裝置、微量分光光度計或酶標儀構成（圖3）。一般流程如下：

（1）配制介質懸液（體積比1∶10），充分混合，通過移液器定量添加到96孔過濾板中，真空抽濾去除溶液，去離子水和平衡緩沖液（200ml）沖洗多次；

（2）添加樣品（200ml）到96孔過濾板，封板膜密封孔板頂部和底部，蓋上過濾板蓋，置于恒溫振蕩儀孵育，控制溫度，保證樣品充分混合；

（3）達到吸附平衡后，移去板蓋，將96孔過濾板放置到真空多聯裝置中，采用真空抽濾方式轉移板內液體，收集到96孔板中；

（4）采用微量分光光度計或酶標儀測定各收集孔內溶液的吸光值，得到蛋白濃度，依據吸附前后的物料平衡計算每個孔板的蛋白吸附量；

（5）添加清洗液，按照步驟（2）～步驟（4）重復操作，測定清洗蛋白量；

（6）添加洗脫液，同樣按照步驟（2）～步驟（4）重復操作，測定洗脫蛋白量；

（7）添加平衡緩沖液進行再平衡后，可重復進行蛋白吸附性能考察。

1.2.1 吸附/解吸條件篩選 在相同蛋白濃度和介質加入量條件下，考察不同介質在不同液相條件下的蛋白吸附量，從而確定合適的介質和吸附/解吸條件。配制不同pH和鹽濃度的BSA溶液，包括8個pH水平，每個pH包含12種不同NaCl濃度；添加介質和200ml蛋白溶液到96孔過濾板，25 ℃、1500 r·min?1金屬浴恒溫振蕩3 h；吸附平衡后，收集溶液，280 nm波長測定蛋白濃度，計算介質的蛋白吸附量，繪出不同pH和鹽濃度條件的結合載量分布圖。

1.2.2 靜態吸附平衡實驗 在特定液相條件下，考察介質在不同蛋白濃度下的吸附量，得到吸附等溫線。選擇合適緩沖液配制0.5、1、2、4、6、8、10 mg·ml?1的BSA溶液。添加200ml到96孔過濾板，恒溫振蕩達到吸附平衡，計算介質的蛋白吸附量，以溶液的平衡蛋白濃度為橫坐標，介質的蛋白吸附量為縱坐標，得到吸附等溫線，并用Langmuir方程擬合吸附等溫線，方程如下

式中，*為介質的平衡吸附量；*為平衡時液相的蛋白濃度；m為飽和吸附容量；d為解離常數。

1.2.3 吸附動力學實驗 在特定液相和蛋白濃度下，考察介質在不同時刻的蛋白吸附量，得到吸附動力學曲線，了解蛋白的吸附動力學過程。其他實驗條件不變，緩沖液配制5 mg·ml?1的BSA溶液，通過改變介質的恒溫孵育時間得到不同吸附時間的蛋白吸附量，吸附時間長的介質先添加蛋白樣品，吸附時間短的介質后添加，控制吸附時間分別為1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50和60 min。以吸附時間為橫坐標，蛋白吸附量為縱坐標，得到吸附動力學曲線，采用孔擴散模型擬合得到有效擴散系數e。

1.2.4 洗脫條件優化 模擬色譜柱內的蛋白吸附和洗脫過程，考察不同洗脫條件對蛋白解吸的影響，優化蛋白洗脫條件。在相同的介質量下，加入200 μl相同濃度的BSA溶液，保持介質的上樣量一致，恒溫振蕩，真空抽濾收集未結合的蛋白溶液；模擬色譜柱pH階躍洗脫過程，添加不同pH的洗脫溶液，恒溫振蕩10 min，收集蛋白洗脫液，測定并計算相應條件下的蛋白洗脫收率。

1.2.5 柱色譜分離實驗 穿透曲線：取1 ml介質填充于Tricorn 5/50色譜柱，高度約5 cm，樣品為BSA溶液，上樣濃度5 mg·ml?1,流速0.5 ml·min?1。UV檢測器檢測穿透液中蛋白濃度，繪制蛋白穿透曲線，考察不同液相條件下10%蛋白穿透的動態結合載量（DBC10%）。

色譜分離：取1 ml介質填充于Tricorn 5/50色譜柱，高度約5 cm，樣品為BSA溶液，上樣濃度5 mg·ml?1，流速0.5 ml·min?1。色譜分離過程包括平衡、上樣、沖洗、洗脫，最后以1 mol·L?1NaCl+1 mol·L?1NaOH溶液進行原位清洗再生。考察不同上樣和洗脫條件下蛋白的洗脫收率，驗證HTPD確定的分離條件。

2 結果與討論

色譜分離過程優化通常包括介質初篩、吸附性能考察、吸附等溫線和吸附動力學測定、柱吸附和洗脫條件優化等，基于微孔過濾板的HTPD可以用于上述的全過程。

（1）介質篩選，微孔過濾板適用于篩選眾多的色譜介質，如96孔板可以同時考察96種介質，并保持其他條件完全相同，克服傳統方法逐一考察和評價的缺點；

（2）吸附性能考察，可以在一個過濾板中考察不同液相條件的蛋白吸附量，確定吸附和解吸條件，相比傳統方法介質和蛋白樣品用量顯著減少，過程一致性提高；

（3）吸附等溫線和吸附動力學測定，可以在特定液相條件下系統考察介質的靜態吸附平衡和吸附動力學性質，為后續色譜分離提供指導；

（4）洗脫條件優化，保持吸附條件一致，可以在一個過濾板中考察介質在不同液相條件下的洗脫效果，確定合適的洗脫條件，提高分離效率。

2.1 基于微孔過濾板的HTPD基本參數優化

為了減少微量操作帶來的實驗誤差，優化了微孔過濾板法HTPD的基本操作參數，系統考察了液固相比、恒溫振蕩轉速和孵育時間的影響。在液相體積（200 μl）不變的條件下，比較了液固體積比為10、15、20、30、40時的蛋白吸附等溫線，發現液固相比為15時數據波動小，重現性好，確定最佳相比15，相應的介質體積14 μl。考察了恒溫振蕩轉速對介質吸附等溫線的影響，發現影響顯著，當轉速大于1100 r·min?1時，吸附數據穩定可靠，為了盡可能消除混合不良造成的影響，選定恒溫振蕩轉速為1500 r·min?1。進一步考察了恒溫孵育時間的影響，發現大于3 h時吸附完全達到平衡，因此后續實驗采用孵育時間3 h。

2.2 介質篩選和吸附性能初步評價

選擇兩種典型的離子交換介質Q Sepharose FF和SP Sepharose FF，以及兩種新型混合模式介質Capto adhere和Capto MMC作為代表，在8個pH水平（4～9）和12種鹽濃度（0～0.4 mol·L?1NaCl）條件下，比較BSA的吸附效果。以pH為橫坐標，鹽濃度為縱坐標，得到不同介質的蛋白結合載量分布，結果如圖4所示。根據結合載量分布圖，可以系統分析不同液相條件的影響，比較不同介質的差異，從而篩選合適的介質和吸附條件。結果表明，兩種具有季銨基團的陰離子交換型介質Q Sepharose FF和Capto adhere的吸附趨勢基本一致，在低鹽、高pH（pH 9.0）或BSA等電點附近（pH 5.5），具有較高的吸附容量（大于80 mg·ml?1）。相比較而言，隨鹽濃度增大，離子交換介質Q Sepharose FF的吸附容量急劇下降，而混合模式介質Capto adhere表現出一定的耐鹽特性，特別是高pH條件下。例如，在pH 9.0和400 mmol·L?1NaCl條件下，Capto adhere仍具有39.3 mg·ml?1吸附容量，而Q Sepharose FF僅為3.5 mg·ml?1。兩種陽離子交換型介質SP Sepharose FF和Capto MMC的趨勢也基本一致，在低pH下吸附容量較高，而高pH下顯著下降。相比較而言，混合模式介質Capto MMC對pH的敏感程度較低，且具有較好的耐鹽吸附性，在較寬pH（3.0～5.0）和鹽濃度（0～400 mmol·L?1NaCl）范圍內吸附容量保持在80 mg·ml?1左右，變化很小。

實驗結果與離子交換介質和混合模式介質的基本特征一致，對于陰離子交換型介質Q Sepharose FF和Capto adhere，當pH大于BSA等電點，蛋白帶有負電荷，與介質配基產生強的靜電相互作用，因此堿性條件促進蛋白吸附；對于陽離子交換型介質SP Sepharose FF和Capto MMC，當pH小于BSA等電點，蛋白帶有正電荷，因此酸性條件下的靜電相互作用促進BSA吸附；兩種混合模式介質Capto adhere和Capto MMC，除了離子交換基團外，還帶有苯環等疏水作用基團，因此高鹽濃度下靜電作用被屏蔽但疏水相互作用得到加強，體現出一定的耐鹽吸附特性。對于Q Sepharose FF和Capto adhere，在BSA等電點附近，吸附容量也較高，可能是蛋白表面電荷分布的不均勻性和弱疏水作用引起[27]，兩種介質可通過弱靜電吸引和疏水相互作用吸附BSA。

2.3 吸附等溫線

基于上述不同介質的吸附條件篩選，進一步利用微孔過濾板，考察特定吸附條件下的吸附等溫線。介質和蛋白溶液量保持不變，每種介質考察8個蛋白濃度的平衡吸附量，平行測定兩組，因此96孔板一次可以得到6組不同介質和條件的吸附等溫線。分別考察了Q Sepharose FF和Capto adhere在兩個 pH（8.5和5.5）、SP Sepharose FF和Capto MMC在pH 4.0時的吸附等溫線，Langmuir吸附等溫式擬合，結果見圖5。可以發現，4種介質的吸附等溫線均符合Langmuir等溫式，在所選定的條件下，均有較高的飽和吸附容量m和較低的解離常數d，說明吸附性能良好。Liu等[28]采用傳統方法測定了pH 8.0下Q Sepharose FF對BSA的飽和吸附量m為137 mg·ml?1±5 mg·ml?1，與本文結果152 mg·ml?1（pH 8.5）較接近。相比其他介質，SP Sepharose FF對BSA的吸附量較高，m達到226.2 mg·ml?1, Yang[29]采用傳統方法測定的m值為194.7 mg·ml?1，與本文結果也較接近。結果表明，基于微孔過濾板的蛋白吸附等溫線測定是切實可行的，具有通量大、物耗小、時間短的HTPD優勢。

2.4 吸附動力學

利用微孔過濾板考察了特定吸附條件下的吸附動力學曲線。介質、樣品體積和液相條件保持不變，每種介質考察16個時間點的蛋白吸附率，96孔板一次可以得到6組不同介質和液相條件的吸附動力學曲線，采用孔擴散模型擬合得到有效孔擴散系數e。對于Q Sepharose FF和Capto adhere兩種介質，在pH 8.5時的e值分別為5.0×10?12和2.5×10?12 m2·s?1，pH 5.5時分別為2.05×10?11和3.2×10?12 m2·s?1。SP Sepharose FF和Capto MMC在pH 4.0時的孔擴散系數e分別為1.09×10?11和5.6×10?12 m2·s?1。進一步比較了1 ml離心管和50 ml燒杯內測定的吸附動力學曲線，發現基本一致，表明微孔過濾板的方法是可靠的。Liu等[28]在200 ml的三口圓底燒瓶中測定Q Sepharose FF吸附BSA的吸附動力學曲線（pH 8.0），得到e值約為6×10?12 m2·s?1，和本文微孔過濾板測得e值相一致。Yang等[30]在250 ml的三口圓底燒瓶中測定了SP Sepharose FF吸附BSA的吸附動力學曲線（pH 4.5），擬合得到e值為7.27×10?12 m2·s?1，也和本文結果基本一致。

2.5 吸附和洗脫優化

基于前文所確定的吸附和解吸條件，進一步利用微孔過濾板，考察不同洗脫條件下的洗脫效果，優化蛋白分離過程。保持介質、樣品體積和蛋白吸附條件保持不變，每種介質考察16種不同的洗脫條件（pH和鹽濃度），96孔板一次可以得到6組不同介質和洗脫條件的結果。結果表明，在加鹽（0.4 mol·L?1NaCl）條件下，不同pH條件下Q Sepharose FF的蛋白洗脫收率均大于90%；不加鹽且pH小于4.0時，降低pH同樣可以得到較好的洗脫效果。由于Capto adhere的耐鹽吸附特性，在加鹽條件下的洗脫效果較差，僅當pH小于4.0時洗脫收率達到80%；不加鹽且pH小于4.0時，洗脫收率大于90%。對于兩種陽離子交換型介質，Capto MMC在加鹽且pH大于6.0時，洗脫收率大于85%；不加鹽且pH大于9.0時具有類似的洗脫效果。SP Sepharose FF在加鹽且pH大于5.0時，洗脫收率大于90%；不加鹽且pH大于6.5時，蛋白的洗脫收率大于85%。

圖6給出了SP Sepharose FF介質的典型結果，并比較了常規1 ml填充柱的蛋白吸附和分離效果。結果表明，上樣條件為pH 4.0，上樣量77.5 mg·ml?1，洗脫條件為pH 7.0，微孔過濾板和常規填充柱的蛋白收率分別為90.0%和96.3%，二者保持一致。其他介質的結果類似，表明基于微孔過濾板的HTPD可以應用于色譜分離過程的優化。本文用的是純蛋白，若對于實際料液，采用以上類似過程可以考察不同洗脫條件的蛋白純度，從而確定合適的分離條件，達到高純度和高收率的要求。

2.6 基于微孔過濾板的HTPD優勢和不足分析

與傳統層析分離過程優化相比，微孔過濾板法的優勢體現在：①資源消耗減小，對于單一介質和蛋白，介質總需要量小于1 ml，蛋白量小于1 g；②實驗通量增大，可以平行篩選多種色譜介質，系統性評價液相條件的影響，一次96孔板就可以考察96個不同的條件，為快速確定最佳條件提供參考；③研發周期縮短，一般過程優化的周期小于一周；④適用性廣，可以進行介質篩選、吸附性能考察，吸附等溫線和吸附動力學測定、吸附和洗脫條件優化等，涵蓋色譜分離優化的全過程；⑤自動化程度和穩定性提高，進一步整合液體工作站，可以提高自動化處理能力，增大過程通量，同時減少人為操作影響，提高數據的穩定性和結果的重復性。

由于是微量操作，也存在一些不足，主要體現在以下幾個方面：①介質和溶液用量少，操作誤差的可能性增大，實驗中需要特別注意，并通過優化操作參數加以避免，還可以利用自動化液體工作站減小批次間差異；②實驗通量大，樣品多，分析檢測耗時顯得更加明顯，采用或開發一些快速、自動的檢測方法很重要，可以顯著提高工作效率；③由于微孔板中介質量少，難以直接考察動態結合載量，可以利用吸附等溫線和吸附動力學數據，通過數學模型間計算獲得。以上幾點不足，需要在實際應用中加以注意。

3 結 論

針對蛋白色譜分離，建立了基于微孔過濾板的HTPD方法，應用于介質初篩、吸附性能考察、吸附等溫線和吸附動力學測定、吸附和洗脫條件優化等過程。優化了96孔過濾板的操作參數，以陰離子交換型介質（Q Sepharose FF和Capto adhere）和陽離子交換型介質（SP Sepharose FF和Capto MMC）為典型對象，采用微孔過濾板考察了BSA的吸附和解吸條件。不同介質表現出不同的特征，整體而言與離子交換介質和混合模式介質的性質相符。分析結合載量分布圖，發現陰離子交換型介質在BSA等電點附近（pH 5.5）和高pH（8.5）低鹽條件下有較高的吸附量，低pH（4.0）有助于蛋白解吸，而陽離子交換型介質在低pH（4.0）條件下有較高的吸附量，中性pH（7.0）有利于蛋白解吸，不過Capto MMC需要在高pH（9.0）高鹽條件下實現有效洗脫。基于介質吸附條件的初篩，進一步采用96孔過濾板測定了BSA的吸附等溫線和吸附動力學曲線，得到了吸附平衡參數和有效孔擴散常數，結果與常規方法保持一致。最后，采用96孔過濾板優化了洗脫條件，得到合適的蛋白分離條件，結果與1 ml填充柱的分離效果一致。結果表明，基于微孔過濾板法的HTPD方法，可以快速、高效地篩選色譜介質和液相，優化蛋白分離條件，具有資源消耗小、實驗通量大、研發周期短、適用性廣、數據穩定性高的特點，后續將用于藥用蛋白的分離過程研發。

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High-throughput screening methods for protein adsorption evaluation with microtiter filter plate

CHU Wenning, LIN Dongqiang, YAO Shanjing

(Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education, College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang, China)

Aiming at the process optimization of chromatographic separation, the high-throughput screening methods of protein adsorption with microtiter filter plate were established for initial resin screening, adsorption properties evaluation, adsorption isotherms and adsorption kinetics measurement, and adsorption and elution conditions optimization. Firstly, the operation parameters of 96-well filter plate were optimized, and with two ion exchangers and two mixed-mode resins as the model, the bovine serum albumin adsorption was investigated with different resins and liquid conditions by means of microtiter filer plate. The binding capacity maps were obtained and the appropriate adsorption-desorption conditions were determined. Further, the microtiter filter plate was applied to measure the adsorption isotherms and adsorption kinetics with four resins at specific adsorption conditions, and the adsorption parameters were obtained. Finally, the elution conditions were optimized using microtiter filter plate. The microscale results were comparable to that with packed-bed separation, indicating that the methods developed in the present work were practicable. The results demonstrated that the high-throughput process development of protein adsorption with microtiter filer plate was feasible and can be used to fast screen the best reins and liquid conditions. New methods showed the advantages of low resource consumption, large experimental fluxes, short developing period, wide application and high stability, which would be one new method for development of the protein separation process.

high-throughput screening ; microtiter filer plate; chromatography; adsorption; protein separation

10.11949/j.issn.0438-1157.20161789

TQ 028.8

A

0438—1157（2017）06—2399—08

林東強。

褚文寧（1990—），男，博士研究生。

國家自然科學基金項目（21476198，21576233）；國際科技合作專項項目（2015DFG42070）。

2016-12-22收到初稿，2017-02-16收到修改稿。

2016-12-22.

Prof. LIN Dongqiang, lindq@zju.edu.cn

supported by the National Natural Science Foundation of China (21476198, 21576233) and the International Science & Technology Cooperation Program of China (2015DFG42070).