1 例兒童靜脈畸形骨肥大綜合征的臨床與基因突變分析

趙麗君，田勇麗，楊躍紅，寇敏

(山西省兒童醫院，山西 太原 030013)

1 例兒童靜脈畸形骨肥大綜合征的臨床與基因突變分析

趙麗君，田勇麗，楊躍紅，寇敏

(山西省兒童醫院，山西 太原 030013)

目的：探討1 例靜脈畸形骨肥大綜合征(KTS)患兒的臨床表現及其分子生物學基礎。方法：收集患者的臨床資料、實驗室檢查結果，抽取外周靜脈血，提取基因組DNA，聚合酶鏈反應，測序確定突變情況。結果：患者臨床表現、實驗室檢查符合KTS診斷?；蛲蛔兎治鲲@示，患者AGGF1基因第6號外顯子發生錯義突變，為c.923A>G雜合突變，造成第923 位氨基酸由天冬酰胺改變為絲氨酸。蛋白序列的保守性分析及突變蛋白的功能分析，均支持該突變為致病突變。結論：通過臨床及實驗室檢查，確診1 例KTS患者，通過AGGF1基因突變分析，從分子遺傳學方面證實患者KTS的診斷。

靜脈畸形骨肥大綜合征；基因突變；兒童

靜脈畸形骨肥大綜合征(KTS)是一種少見的先天性靜脈畸形病變，1900年由法國醫師Klippel和Trenaunay首次報道，其以血管畸形、骨肥大和軟組織增生為主要臨床表現[1]。本病好發于兒童及青少年，病程進展緩慢，病情復雜，并隨年齡增長而加重，部分患者可伴有多趾、巨趾、并趾畸形及淋巴系統異常，下肢多見。目前本病的遺傳方式不明確，多數認為AGGF1基因的變異與KTS相關[1]。本研究分析1 例KTS患者的臨床、實驗室檢查和AGGF1基因突變情況，旨在探討KTS患者的臨床表現及分子生物學基礎，以提高對本病的認識。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患兒，女，7 歲，因血尿8 d于2016年7月就診于山西省兒童醫院?；純? d前無誘因出現肉眼血尿，尿液呈醬油色，無泡沫、少尿，無水腫，病初1 d伴低熱，體溫37.5 ℃左右，有輕咳，無痰，無皮疹、關節腫痛，無頭痛、頭暈，無惡心、嘔吐、尿頻、尿急、尿痛等癥狀，在當地醫院診斷“急性腎小球腎炎”，輸液治療7 d(具體用藥不詳)病情無明顯好轉，為求進一步診治入住我科。既往史、個人史、家族史無特殊。入院查體：體溫37 ℃，脈搏92 次/min，呼吸20 次/min，血壓121/54 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，神清，反應可，四肢、頸部、背部、臀部均可見大片狀紅色斑疹，淺表淋巴結未觸及腫大，咽充血，雙肺呼吸音粗，未聞及干濕啰音，心音有力，律齊，腹軟，肝脾肋下未及，雙腎區叩痛陰性，移動性濁音陰性，腸鳴音正常。右手拇指背面可見一花生大小突起皮面的贅生物，右手中指、食指粗大，中指外翻(見圖1)。入院診斷：血尿原因待查，急性腎小球腎炎？上呼吸道感染。經皮膚科會診，補充診斷：骨肥大靜脈曲張痣綜合征。

經患者知情同意，山西省兒童醫院倫理委員會同意，抽取外周血，提取基因組DNA進行基因分析。

1.2 基因分析方法

1.2.1 基因組DNA提取

圖11 例靜脈畸形骨肥大綜合征患兒的臨床表現

采集患兒靜脈血2 mL，置乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，用DNA提取試劑盒(康維世紀，北京)提取外周血白細胞基因組DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應(PCR)

1.2.2.1 引物設計

使用UCSC數據庫查找AGGF1基因序列，試用Primer3.0進行引物設計，設計完成后進行序列合成，擴增AGGF1基因的14 個外顯子及其與內含子的交界處，引物由北京邁基諾基因科技股份有限公司合成。AGGF1基因擴增引物(見表1)。

表1 AGGF1基因擴增引物

1.2.2.2 PCR擴增條件

95 ℃預變性60 s，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環35 次；后72℃延伸5 min，循環反應結束后取4 μL PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物片段大小。

1.2.3 DNA測序

采用DNA純化回收試劑盒(北京邁基諾基因科技股份有限公司)純化回收PCR產物。再進行上機前PCR，采用之前設計好的引物，PCR反應條件為：96 ℃預變性1 min 30 s；96 ℃變性12 s，50 ℃退火6 s，60 ℃延伸3 min 20 s，循環25 次。反應結束后取PCR產物，送北京邁基諾基因科技股份有限公司用ABI3130熒光自動測序儀(ABI，美國)測序。

1.2.4 測序結果分析

測序結果與人類參考基因組(hg19)進行比對分析，確定突變位點及突變堿基。然后通過ANNOVER軟件對突變位點進行注釋，注釋內容包括dbSNP數據庫、HGMD數據庫和正常人數據庫1 000 Genomes、ESP6 500和ExAC等。根據注釋信息排除多態性位點，確定其是否為已報道致病突變或新發突變位點。

1.2.5 對突變蛋白的功能預測

首先分析突變位點在不同物種中的保守性，其次使用非同義突變功能預測軟件SIFT[2]、Polyphen-2[3]、Mutation Taster[4]對含錯義突變的AGGF1蛋白進行致病性預測。

2 結 果

2.1 實驗室和影像學檢查結果

血系列：白細胞計數4.15×109/L，中性粒細胞0.436，淋巴細胞0.388，單核細胞0.145，嗜酸性粒細胞0.029，紅細胞計數4.0×1012/L，血紅蛋白濃度122 g/L，血小板計數222×109/L，C反應蛋白0.5 mg/L。生化：丙氨酸氨基轉移酶12 U/L，天冬氨酸氨基轉移酶31 U/L，γ-谷氨酰轉肽酶10 U/L，白蛋白31.7 g/L，球蛋白25.8 g/L，尿素氮3.1 mmol/L，肌酐53 μmol/L，總膽固醇3.66 mmol/L，電解質正常。凝血功能：凝血酶原時間14.0s，纖維蛋白原3.94 g/L，活化部分凝血活酶時間31.7 s，凝血酶時間18.9 s。免疫球蛋白G(IgG)10.4 g/L，免疫球蛋白A(IgA)3.63 g/L，免疫球蛋白M(IgM)1.08 g/L，總免疫球蛋白E(IgE)26.9kIU/L，補體C31.06 g/L，補體C40.234 g/L。淋巴細胞亞群：T細胞68.9%，輔助性T細胞(Th)35.1%，抑制性T細胞(Ts)29.0%，Th/Ts 1.21，自然殺傷(NK)細胞4.8%，細胞因子誘導的殺傷(CIK)細胞2.4%，B細胞23.0%。血沉45 mm/h。肺炎支原體抗體陰性，院感九項正常。尿常規為：酸堿度6.56，蛋白質陰性，紅細胞200.00個/μL，尿紅細胞位相：蛋白(+-)，紅細胞數目>100個/HPF，變形60%，形狀草莓、面包圈、穿孔，24 h尿蛋白定量0.34 g/24 h。腎早期損傷檢測：尿IgG 14.5 mg/L，尿微量白蛋白87.4 mg/L，尿轉鐵蛋白4.58 mg/L，尿α1微球蛋白5.59 mg/L，便常規正常。胸片：雙肺紋理粗多紊亂。腹部彩超：雙腎大，與原發病有關。胃腸道彩超：腹腔內未見明顯異?；芈暋?/p>

2.2 基因突變分析結果

2.2.1 PCR擴增產物檢測

以患者DNA為模板，分別用引物進行PCR擴增，產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳EB染色后，均見一條清晰條帶，且與預期片段大小相符(見圖2)。

圖2 AGGF1擴增后1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測

2.2.2 基因突變分析

測序結果顯示，患者的AGGF1基因第6號外顯子發生錯義突變，為c.923A>G雜合突變，造成第923位氨基酸由天冬酰胺突變為絲氨酸，即p.N308S(見圖3)，測序結果與人類參考基因組(hg19)比對，再通過ANNOVER軟件對突變位點進行注釋，表明c.923A>G不是多態性位點，確定其為未報道過的新突變。突變蛋白的功能預測：AGGF1蛋白923位的天冬酰胺在人，大鼠，小鼠，兔，牛，馬，荷蘭豬，恒河猴，狗中高度保守，同時SIFT、Polyphen-2和Mutation Taster對錯義突變的功能影響預測結果：該突變可能影響AGGF1蛋白的功能，是致病性突變。SIFT、Polyphen-2和Mutation Taster評分分別為1、0.001和1。

3 討 論

KTS是一種以靜脈畸形合并其他多器官畸形的先天性疾病，在起病早期由于癥狀不典型，常被誤診為“胎記”“血管瘤”“靜脈曲張”等疾病，延誤了正常的診治，導致患兒成長后殘疾，因此目前已引起學者們的高度重視。在KTS三聯征中，一般以血管瘤(痣)最先出現者為多，多在出生時即有或在出生后不久出現，以后隨年齡增長，逐漸出現淺靜脈曲張和骨、軟組織增生。本病累及內臟及顱內血管時，還可出現膀胱、脾、結腸、肝臟等內臟血管畸形，可表現為消化道出血、泌尿道出血、腦出血。Husmann等[5]報道KTS患者中30%泌尿生殖系統受累，其中7%累及生殖器皮膚，7%累及泌尿生殖內臟器官，16%二者均累及。9%的KTS患者出現肉眼血尿，分別來自膀胱、尿道及腎臟。本例患兒急性起病，以肉眼血尿為主要表現，伴輕度蛋白尿，化驗尿紅細胞位相：紅細胞>100個/HPF，變形60%，24 h尿蛋白定量0.34 g/24 h，診斷急性腎小球腎炎。本病易合并血管畸形，故未行腎活檢。給予阿魏酸哌嗪、卡托普利、百令膠囊治療后，肉眼血尿明顯減輕，出院后2 個月復查尿常規、腎早期損傷檢測等均正常。KTS的病因及發病機制目前尚不清楚[6]，多數認為與先天性中胚層血管發育異常、遺傳及基因突變有關。由于胎兒時期發育成血管和軟組織的中胚層發育異常，導致相應部位的肢體淺靜脈數量增多，管徑擴大和血流增加；深靜脈發育細小、閉塞或瓣膜缺如[7]，進而肢體血容量持續增多造成骨骼和軟組織過度生長[8]，引起患肢一系列臨床表現。研究表明AGGF1基因的變異與KTS相關，AGGFl基因全長34 kb，由14 個外顯子組成，編碼714 個氨基酸，所表達的蛋白相對分子量為81 kD，AGGF1基因編碼一個強效血管生成因子，可以促進血管內皮細胞的增殖。KTS相關的基因突變導致血管生成因子活性增強，這是形成KTS病理改變的分子基礎[7]。本例患者行基因檢測明確為AGGF1基因第6號外顯子發生錯義突變，為c.923A>G雜合突變，造成第923 位氨基酸由天冬酰胺改變為絲氨酸。通過對不同種屬該位點的蛋白序列的保守性分析及多種點突變功能預測軟件分析，均支持該突變為致病突變。本例患者的突變屬于新突變，其父母均檢測到AGGF1基因的雜合突變，但未發病，結合類似研究報道，我們認為KTS是一類具有遺傳基礎的先天性疾病，AGGF1基因可能不是該例病患發病的唯一突變基因，KTS發病可能有其他基因作為致病基因，也可能在整個血管母細胞分化和血管的發生形成通路中存在其他基因的影響，需要做進一步的研究。

A為患兒AGGF1基因第6外顯子序列；B為患兒父親AGGF1基因第6外顯子

綜上所述，KTS是一類以血管發育異常為主的少見疾病，其病因與發病機制仍在不斷研究探索中，若小兒時期能夠早期發現，明確病變類型和程度，可盡早施行正確、有效的個體化治療方案。

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(本文編輯：張紅)

Clinical and genetic analysis of a child with klippel-trenaunay syndrome.

ZHAO Lijun，TIAN Yongli，YANG Yuehong，KOU min

( Shanxi Children′s Hospital，Tianyuan 030013，China)

Objective：To investigate the clinical manifestations and molecular basis of a child with Klippel-Trenaunay syndrome(KTS).Methods：Clinical features，and laboratory data were collected.Genomic DNA was extracted from leukocytes of peripheral blood of the patient，detected by polymerase chain reaction，and the mutations identified by direct sequencing.Results：KTS was diagnosed on the basis of comprehensive consideration of clinical presentations，and laboratory test results.This gene mutation test revealed a nucleotide substitution of guanine for adenine at the position 923 of exon 6 of AGGF1 gene (c.923A>G)，which caused a missense mutation of asparagine to serine at codon 923 (p.Asn923Ser).Loci conservation analysis and functional prediction of missense mutation of AGGF1 protein revealed that c.923A>G was a pathogenic mutation.Conclusion：One case of KTS was diagnosed by clinical and laboratory examinations.From the aspect of molecular genetics，AGGF1 gene mustation has confirmed the diagnosis of KTS in this patient.

klippel-trenaunay syndrome；gene mutation；child

王利榮(1965— )，女，山西省五臺縣人，學士學位，副主任醫師，主要從事心內科工作。

1671-8631(2017)05-0354-05

R394

B

2016-12-27