心理應激對腸易激綜合征模型大鼠腸黏膜孤啡肽受體表達的影響

王 鑫，巨 偉，李武良，李 萍，李 鑫

西安市第九醫院消化內科，陜西 西安 710054

心理應激對腸易激綜合征模型大鼠腸黏膜孤啡肽受體表達的影響

王 鑫，巨 偉，李武良，李 萍，李 鑫

西安市第九醫院消化內科，陜西 西安 710054

目的 檢測心理應激對腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)大鼠腸黏膜孤啡肽受體(ORL-1)mRNA和蛋白表達水平，初步探討心理應激對IBS大鼠的影響。方法 80只SD雌性大鼠隨機分為對照組和實驗組，每組40只，實驗組采用束縛應激的方法制作IBS動物模型，并對模型進行鑒定。實驗0、1、2、3、4周時兩組分別隨機取出8只大鼠，在近端結腸(距回盲部2 cm)處取2塊黏膜，采用熒光定量PCR法檢測ORL-1 mRNA的相對表達量，同時用Western blotting的方法檢測ORL-1蛋白，動態觀察各組大鼠的表達變化。結果 與對照組相比，實驗組大鼠ORL-1 mRNA及蛋白表達水平均升高(P<0.05)，應激1周時最高，2～4周逐漸下降。實驗組與對照組差異有統計學意義(P<0.05)。結論 慢性心理應激引起大鼠IBS的發生機制可能與其影響大鼠腸道腸黏膜孤啡肽受體(ORL-1)mRNA及蛋白表達量相關。

心理應激；腸易激綜合征；孤啡肽受體；熒光定量PCR法；Western blotting

目前腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是臨床上最常見的胃腸功能紊亂性疾病，其主要病理生理基礎是胃腸道無器質性病變而感覺動力異常。有研究認為胃腸動力障礙性疾病與腸神經系統的變化密切相關，IBS與腸神經系統的關系被認識，因此，近年來，把IBS當成一種心身性疾病來研究已成為焦點。心理性應激是引起腸神經系統異常的一種方式，消化道的部位不同，影響的結果也有所不同，但大量的研究已經證明：心里應激使結腸的運動顯著性加強[1-3]。

孤啡肽又稱痛敏素，體內廣泛分布，在中樞神經系統及消化道內都能檢測到，發揮重要的神經內分泌調節作用。在痛覺調控方面，孤啡肽具有抗阿片的效應，在腦室注射孤啡肽后會產生異常疼痛以及疼痛敏感性增加，而其在脊髓中的作用卻能加強阿片鎮痛。有關OFQ的研究大多集中于它在痛覺調控方面的作用，也有研究證明：在胃腸道功能的調節方面OFQ也有至關重要的作用，能夠有效刺激結腸收縮，加速結腸轉運，因而與結腸動力紊亂的發生密切相關，同時很可能參與了應激狀態下消化系統的調節[4-6]。但OFQ及其受體在IBS發生中具有怎樣的作用，目前相關研究尚少見報道。本次研究主要明確慢性心理應激對大鼠腸道腸黏膜孤啡肽受體(ORL-1)表達的影響，旨在探討其在IBS發病機制中的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 體質量為200～220 g清潔級Sprague-Dawley雌性大鼠80只，在本實驗室適應性喂養1周，恢復各項生理正常指標。大鼠喂養混合飼料，在自然光線、安靜、室溫(18～20 ℃)、晝夜循環12/12 h條件下飼養。

1.2 分組與造模 實驗組和對照組各40只大鼠，根據應激時間隨機分為0、1、2、3、4周組，每組8只。將實驗組大鼠置于自制束縛器內，3 h/d，限制活動，不固定具體的每天束縛時間，并在束縛時間內禁食、禁水；同一時間，對照組大鼠也禁食、禁水，但可以自由活動。實驗過程中無大鼠死亡。在大鼠近端結腸(距回盲部2 cm)取2塊黏膜活檢。黏膜標本取材后立刻放于液氮內，隨后轉入超低溫冰箱-80 ℃保存，準備用于后續實驗。

1.3 主要試劑及儀器 TrizolReagant RNA提取試劑盒購自Aidlab公司，逆轉錄試劑盒購自VAZYME公司，引物設計參照文獻，由北京擎科生物公司合成，熒光染料PCR試劑盒AceQ qPCR SYBR Green Master Mix公司。ABI實時熒光定量PCR儀(Viia7)。

1.4 總RNA提取 將組織樣本加入1 ml Trizol試劑，勻漿器研磨成漿，移至無RNase的1.5 ml離心管中，裂解10 min，然后加入200 μl氯仿，劇烈顛倒混勻數次，室溫靜置5 min。4 ℃，12 000 r/min，離心15 min后可見分成上(RNA)中(蛋白)下(DNA)三相。轉移上層水相(約400 μl)于另一新1.5 ml離心管中，加入400 μl異丙醇，混勻后室溫靜置10 min。離心10 min，管底可見白色的RNA沉淀。棄上清，加入無RNase的75%乙醇1 ml，渦旋混勻后，重復一次。棄上清，空氣中干燥RNA沉淀5～10 min，將沉淀溶于20 μl DEPC水中。取溶解后的RNA 2 μl用微量分光光度計測定樣本的濃度和純度。

1.5 cDNA合成 根據VAZYME公司的逆轉錄試劑盒的操作說明合成cDNA，逆轉錄反應的體系。20 μl體系中含5 μl RNA，2 μl Oligo (dT) 15 (10 μmol/L)，4 μl dNTP (2.5 mmol/L)，4 μl Hiscript Buffer，1 μl Hiscript Reverse Transcriptase，0.5 μl Ribonuclease Inhibitor和3.5 μl ddH2O。反應條件為25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min反轉錄反應，85 ℃ 5 min反轉錄酶失活反應，立即放置4 ℃冰箱。

1.6 熒光定量PCR反應 用Primer 5設計大鼠腸黏膜ORL-1及GAPDH引物：ORL-1上游引物:5′-TGGCTTCAGTGGTTGGTGTT-3′，下游引物:5′-CAGGTTTCGGTCCTTCTCCC-3′,擴增片段長245 bp；GAPDH上游引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′，擴增片段長253 bp。以cDNA為模板，按AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒說明進行進行Real-time PCR。20 μl體系中含10 μl SYBR Green Master Mix (2×)，0.4 μl PCR Forward Primer(100 μmol/L)，0.4 μl PCR Reverse Primer(100 μmol/L)，0.2 μl ROX Reference Dye 2(50×)，4 μl cDNA和5 μl ddH2O。PCR程序采用兩步法，具體步驟：95 ℃預變性10 min，1個循環；95 ℃變性30 s，60 ℃退火和延伸30 s，40個循環。實驗重復3次，計算均值。擴增完畢后分析熔解曲線，采用2-ΔΔCt法分析ORL-1 mRNA表達。

1.7 Western blotting分析大鼠腸黏膜ORL-1蛋白的表達情況 勻漿器中球狀部位放入組織塊，向勻漿器中加入400 μl單去污劑裂解液裂(含PMSF)進行勻漿，研磨操作需要在冰上，研磨多次后，冰浴30 min，將組織勻漿液轉移到1.5 ml離心管，4 ℃，12 000 r/min，離心5 min后，取0.5 μl上清蛋白提取液，進行BCA法蛋白定量。總蛋白變性5 min，凝膠的配置濃度為12%的SDS-PAGE，按順序進行蛋白上樣并進行電泳，電泳分離蛋白后，使用電轉移槽轉移至PVDF膜。在室溫條件下，將膜放入裝有BSA器皿封閉2 h后，PVDF膜轉到置于按1∶1 000稀釋的ORL-1多克隆抗體稀釋液中，于4 ℃冰箱內孵育過夜。TBST充分洗膜4次，每次5 min。再置于按1∶10 000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG稀釋液中37 ℃孵育2 h，TBST充分洗膜4次，每次5 min。采用ECL發光液進行顯影，運用 Image J 軟件進行條帶圖像分析。

2 結果

2.1 慢性心理應激對大鼠腸黏膜ORL-1 mRNA表達的影響 對照組和實驗組結腸黏膜均可檢出ORL-1 mRNA的表達。實時熒光定量 PCR 得出的數據經 2-ΔΔCt法分析，結果顯示：應激后1周實驗組ORL-1 mRNA表達水平最高，2～4周逐漸降低，但仍明顯高于應激前水平。與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 慢性心理應激對大鼠腸黏膜ORL-1的蛋白表達的影響 1周實驗組ORL-1 蛋白表達水平最高，2～4周逐漸降低，但仍明顯高于應激前水平，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05，見表2、圖1)。

分組0周1周2周3周4周對照組1.000±0.1721.117±0.2071.283±0.1651.163±0.2111.156±0.233實驗組1.023±0.1952.824±0.376*2.217±0.290*1.733±0.301*1.629±0.308*

注：與對照組比較 ，*P<0.05。

圖1 兩組不同時間點腸黏膜ORL-1蛋白表達

Fig 1 Expressions of intestinal mucosal ORL-1 protein in two groups

3 討論

心理應激在功能性腸道疾病特別是IBS疾病中普遍認為發揮重要作用，并且心理應激會加速和加強IBS疾病的發生和發展。應激又稱為應激反應，是指機體受到內外各種環境因素刺激時所出現的全身非特異性適應反應。應激最直接表現即精神緊張，隨后引起廣泛的神經內分泌變動并且表現為內臟敏感性增強。其中慢性束縛可長期提高腦垂體和腎上腺皮質分泌一些相關的激素，最終通過下丘腦-垂體-腎上腺軸對內臟如腸道發生作用[7]。慢性束縛是在相當長一段時間內，持續進行一定強度的刺激，使機體因為長期處于過強的應激狀態下，而最終表現可為IBS。慢性束縛所產生的心理應激會直接引起機體相關的特異性變化，除此之外還會引起一系列與慢性束縛無直接關系的非特異性反應繼而發生神經內分泌反應，及細胞和體液中某些蛋白質成分的改變。

分組0周1周2周3周4周對照組1.000±0.1141.042±0.2161.145±0.1751.121±0.1981.103±0.184實驗組1.023±0.1412.148±0.312*1.814±0.175*1.698±0.286*1.537±0.265*

注：與對照組比較，*P<0.05。

中樞神經系統(central nervous system, CNS)與腸神經系統(enteric nervous system, ENS)之間存在密切的相互關系。內源性阿片肽主要通過其受體在中樞神經系統發揮作用，有顯著鎮痛功能和作用。孤啡肽及孤啡肽受體(opioid receotor-like 1 receptor,ORL1)是內源性阿片肽系統里新發現的一種成員，廣泛分布于中樞神經系統及胃腸道中，并且參與對神經損傷和疼痛的調節，其對腦損傷中的具體作用及作用機理已經進行了大量的研究[8-10]，而在胃腸道中發生的作用還有待關注。OFQ/ORL-1系統在胃腸道的調節過程中并不直接作用于腸道肌細胞而是通過對腸神經系統的調節間接發揮作用[11-13]。

已有研究[14]顯示：ORL-1在近端結腸較為豐富，因此本次實驗在近端結腸(距回盲部2 cm)處取2塊黏膜進行實驗，以提高實驗的準確性。發現對照組和實驗組結腸黏膜均可檢出ORL-1表達，充分說明OFQ/ORL-1系統在人的胃腸運動的調節中很可能有至關重要的作用。同時我們對比了正常大鼠與慢性心理應激大鼠間腸道ORL-1表達的差異。發現慢性心理應激大鼠結腸處的ORL-1表達量顯著高于正常大鼠。說明不但腦腸軸神經系統受OFQ/ORL-1系統的調控，很可能腦腸軸神經對OFQ/ORL-1系統也具有一定調節作用，并表現為患者ORL-1表達量的變化。這在其他研究中也得到證實[11]。并且在1周內達到峰值，而在隨后的2～4周逐漸下降，但始終高于對照組，在我們前期實驗已經發現[15]：應激后1周血漿OFQ水平最高，2～4周逐漸降低，但仍明顯高于應激前水平，且OFQ含量的變化與腸道敏感性的改變呈顯著相關關系。結腸黏膜ORL-1的表達與血漿OFQ含量的變化趨勢一致，推測，結腸黏膜ORL-1的表達變化與腸道敏感性的改變也具有相關性。同時兩次實驗發現慢性心理應激時腸道敏感性、血漿OFQ及腸黏膜ORL-1表達均增高，并隨著應激時間延長逐漸降低，這一現象說明IBS可能與長期應激產生的適應性有關[16-17]。

綜上所述，我們發現慢性心理應激引起的IBS發生機制可能與其促進大鼠腸道腸黏膜孤啡肽受體(ORL-1) mRNA及蛋白表達量上調相關。OFQ/ORL-1系統參與了由慢性心理應激引起IBS的病理演變過程，對此類胃腸病的發生發揮著一定的作用，當然，ORL-1的分布及數量在不同動物胃腸道中存在較大差異，調節機制及作用部位都有差異[18]，因此，對于人類的此項研究需進一步深入探討，其作用機制與途徑也有待于進一步深入研究。

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(責任編輯：馬 軍)

Effect of psychological stress on expression levels of intestinal opioid-receptor-like-1 mRNA and protein in rats models of irritable bowel syndrome

WANG Xin, JU Wei, LI Wuliang, LI Ping, LI Xin

Department of Gastroenterology, Xi’an Ninth Hospital, Xi’an 710054, China

Objective To investigate the effect of psychological stress on expression levels of opioid-receptor like-1 (ORL-1) mRNA and protein in irritable bowel syndrome (IBS) models rats.Methods Eighty Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group (n=40) and model group (n=40). IBS models were established by restrain stress method. Eight rats in each group were sacrificed at 0, 1, 2, 3, 4 weeks， respectively, and a partial colon tissue close to the ileocecal region about 2 cm in length was taken; and expression level of ORL1 mRNA was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), and expression level of ORL1 protein was detected by Western blotting.Results Compared with the control group, the expression levels of ORL1 mRNA and protein significantly were increased in model group at 1, 2, 3 and 4 weeks (P<0.05). The expression levels of ORL1 mRNA and protein at 1 week was the highest in model group, then gradually decreased at 2～4 weeks.Conclusion The effect of psychological stress on IBS in rats is possibly related to the up-regulation of expression levels of ORL1 mRNA and protein.

Psychological stress; Irritable bowel syndrome; ORL-1; RT-PCR; Western blotting

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.05.009

2010年陜西省衛生廳科研基金

王鑫，碩士，主任醫師兼科主任，研究方向：胃腸疾病及動力方面的研究。E-mail:252705009@qq.com

R574.4

A

1006-5709(2017)05-0514-04

2016-11-20