TERT基因轉染BMSC血管性癡呆大鼠記憶功能及海馬CA1區突觸可塑性的影響*

段金旗，馬麗瓊，劉遠林，任 煒，陳媛媛，李春巖

(1.張家口學院醫學院，河北張家口 075000；2.解放軍251醫院重癥醫學科，河北張家口 075000；3.河北醫科大學第二醫院神經內科，石家莊 050000)

·論 著·

TERT基因轉染BMSC血管性癡呆大鼠記憶功能及海馬CA1區突觸可塑性的影響*

段金旗1，馬麗瓊2，劉遠林1，任 煒1，陳媛媛1，李春巖3

(1.張家口學院醫學院，河北張家口 075000；2.解放軍251醫院重癥醫學科，河北張家口 075000；3.河北醫科大學第二醫院神經內科，石家莊 050000)

目的 探討端粒酶逆轉錄酶(TERT)基因轉染骨髓基質干細胞(BMSC)對血管性癡呆大鼠記憶功能及海馬CA1區突觸可塑性的影響。方法 60只大鼠隨機分為陰性對照組(A組)、模型組(B組)、常規BMSC組(C組)和轉染BMSC組(D組)；采用Morris迷宮測試、RT-PCR和蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠相關指標。結果 C組、D組逃避潛伏期顯著長于B組；D組逃避潛伏期顯著長于B組。與A組比較，B組、C組、D組腦源性神經營養因子(BDNF) mRNA、TERT mRNA、突觸前區突觸素(SYP)mRNA及蛋白表達均顯著降低，A組大鼠突觸間隙排列清晰，SYN陽性細胞數較多；D組突觸間隙更為清晰，SYN陽性細胞數量和突出間隙排列結構都接近于A組。結論 TERT轉染BMSC對血管性癡呆大鼠的治療作用明顯，其作用機制與促進BDNF、TrkB表達、改善突觸的可塑性有關。

端粒酶逆轉錄酶；骨髓基質干細胞；癡呆,血管性；記憶功能；突觸；可塑性

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是腦血管病所誘發的智力損害，目前VD已經成為老年期癡呆的主要病因之一[1-2]。骨髓基質干細胞(bone marrow stem cell,BMSC)具有促進神經元細胞分化能力，是一種理想的種子細胞[3]。有報道稱對腦缺血大鼠移植BMSC能夠促進腦組織重塑和血管再生[4]；然而在移植BMSC過程中常發生BMSC衰老、凋亡以及增殖不穩定情況，表現為突觸前區突觸素(synaptophysin,SYP)數量、密度顯著降低，這可能與端粒酶活性降低有關[5]。鑒于此，本研究將端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)轉染的BMSC移植至VD大鼠中，觀察大鼠的行為學及海馬CA1區SYP、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)其受體酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase B,TrkB)變化水平，旨在為VD的治療提供依據，現將研究成果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物來源 本研究設計動物實驗及操作均經張家口學院倫理委員會審核批準。60只健康SD級成年雄性大鼠購自河北北方學院動物實驗中心，體質量240～310 g，平均(278.5±13.7)g。所有大鼠均常規自由進食進水，喂養室溫20～22 ℃，空氣濕度50%，光照12 h后黑暗12 h晝夜交替，待飼養1周后進行實驗。

1.2 主要儀器與試劑 Lipofectamine 2000購自美國ATCC公司；DMEM培養基購自美國HyClone公司；TERT、BMSC均購自上海桑尼生物科技有限公司；BDNF、TrkB、SYP抗體均購自美國Sigma公司。PCR儀購自美國ABI公司；H-7650透射電鏡購自日本日立公司；Nucleofector Ⅱ細胞核轉染儀瑞士Lonza公司。

1.3 方法

1.3.1 VD大鼠模型的制備 60只大鼠按照隨機數字表分為陰性對照組(A組)、模型組(B組)、常規BMSC組(C組)和轉染BMSC組(D組)，每組各15只；其中陰性對照組不給于任何干預措施，VD大鼠模型制備方法：采用結扎雙側頸總動脈(2-VO)法[6]：術前大鼠禁水4 h、禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛(注射劑量：0.5 mL/100 g)；待大鼠麻醉后置于操作臺上，取出頸部毛，常規消毒將于頸部正中做一約2～3 cm切口，皮下組織鈍性分離后將氣管充分暴露，用眼科鑷將氣管兩側頸總動脈逐層分離并顯露，再采用3-0縫合線將雙側頸總動脈結扎，確認結扎成功后縫合傷口，并涂抹萬古霉素消毒。大鼠蘇醒后常規進食進水，檢測大鼠生命體征并觀察行為變化。術后第2天將存活的大鼠進行Morris迷宮測試，大鼠平均逃避潛伏期大于2倍對照組大鼠平均逃避潛伏期判定為VD大鼠造模成功標準。

1.3.2 TERT轉染BMSC 將BMSC接種于6孔板中，分為3組：對照組、逆轉錄病毒載體(plxsn)組，plxsn-TERT組，待細胞匯合率達到90%時，分別于每孔加入3 μg載體、Lipofectamine 2000 10 mL、LDMEM培養基3 mL，轉染6 h后更換培養基，轉染24 h后進行傳代(1∶10)，轉染48 h后加入G418(200 μg/mL)篩選。

1.3.3 BMSC細胞移植 A組和B組不注射任何藥物，常規喂養；常規BMSC組尾靜脈注射1 mL BMSC(濃度：4×106個/mL)，轉染BMSC組組尾靜脈注射1 mL TERT-BMSC(濃度：4×106個/mL)；注射后常規喂養6周。

1.4 觀察指標 (1)移植2個月后對4組大鼠采用Morris迷宮測試[7-9]：①定位航行測試，將大鼠分別從4個象限放入水中，記錄大鼠的逃避潛伏期；②空間探索測試：撤去平臺，記錄120 s內大鼠在第一象限停留的時間。(2)將大鼠處死，快速切取大鼠海馬CA1區組織，采用Trizol法提取腦組織RNA并逆轉錄成cDNA，以β-actin為內參，采用RT-PCR法檢測組織中BDNF mRNA、TrkB mRNA、SYP mRNA表達水平。RT-PCR總反應體系20 μL，其中cDNA 3 μL，上下游引物0.5 μL。設置PCR反應條件：94 ℃預變性30 s，95 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，總計30個循環；各引物序列及長度見表1。(3)采用蛋白免疫印跡檢測大鼠海馬CA1區BDNF、TrkB、SYP蛋白表達：取各組大鼠海馬CA1區腦組織200 g，加入1 mL蛋白酶抑制劑，提取總蛋白。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離各蛋白，再將分離出的蛋白轉移至PVDF膜上25 mA恒流過夜。分別加入BDNF、TrkB、SYP一抗室溫孵育2 h，再加入辣根過氧化物標記的二抗室溫孵育1.5 h，最后加入辣根過氧化物標記的actin抗體，經化學發光法檢測，圖片掃描保存，計算目的蛋白相對含量，其中目的蛋白相對含量=目的蛋白灰度值/內參actin蛋白灰度值。(4)切取海馬CA1區腦組織，常規固定、切片、染色后，用透射電鏡觀察海馬CA1區神經元突觸的超微結構。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 A組大鼠均正常喂養，全部存活；B組有3只大鼠在行頸總動脈結扎時死亡，其余12只存活；C組有2只在頸總動脈結扎時死亡，2只因腹腔感染死亡，其余11只存活；D組1只在頸總動脈結扎時死亡，1只在注射TERT-BMSC后第2天不明原因死亡，其余13只存活；各組存活大鼠生長發育情況良好。

表1 RT-PCR各引物序列及長度

2.2 TERT mRNA表達及端粒酶活性與對照組和plxsn組比較 plxsn-TERT組TERT mRNA表達水平顯著升高，端粒酶活性也顯著上升，見圖1～2。

1：對照組；2：plxsn組；3：plxsn-TERT組。

圖1 各組TERT mRNA表達水平

1：對照組；2：plxsn組；3：plxsn-TERT組。

圖2 各組端粒酶活性

2.3 各組大鼠Morris迷宮測試結果比較 B組、C組、D組逃避潛伏期顯著長于A組，第一象限停留時間顯著少于A組(P<0.05)；C組、D組逃避潛伏期顯著長于B組，第一象限停留時間顯著少于B組(P<0.05)；D組逃避潛伏期顯著長于C組，第一象限停留時間顯著少于C組(P<0.05)，見表2。

2.4 各組大鼠海馬CA1區BDNF mRNA、TrkB mRNA、SYP mRNA表達水平 與A組比較，B組、C組、D組BDNF mRNA、TrkB mRNA、SYP mRNA均顯著降低(P<0.05)，其中D組BDNF mRNA、TrkB mRNA、SYP mRNA顯著高于B組、C組(P<0.05)，C組BDNF mRNA、TrkB mRNA、SYP mRNA又顯著高于正常值(P<0.05)，見圖3、表3。

表2 各組大鼠Morris迷宮測試結果比較

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較；c：P<0.05，與C組比較。

表3 各組大鼠海馬CA1區BDNF mRNA、TrkB mRNA、SYP mRNA表達水平

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較；c：P<0.05，與C組比較。

1：A組；2：B組；3：C組；4：D組。

圖3 各組大鼠海馬CA1區BDNF mRNA、TrkB mRNA、SYP mRNA表達水平

表4 各組大鼠海馬CA1區BDNF、TrkB、SYP蛋白表達水平

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較；c：P<0.05，與C組比較。

2.5 各組大鼠海馬CA1區BDNF、TrkB、SYP蛋白表達水平與陰性對照組比較 B組、C組、D組BDNF、TrkB、SYP蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，其中D組BDNF、TrkB、SYP蛋白表達水平顯著高于B組、C組(P<0.05)，C組BDNF、TrkB、SYP蛋白表達水平又顯著高于B組(P<0.05)，見圖4、表4。

2.6 各組大鼠海馬CA1區突觸素觀察結果比較 A組大鼠突觸間隙排列清晰，SYN陽性細胞數較多；B組突觸間隙排列紊亂，SYN陽性細胞數量明顯減少；C組突觸間隙較模型組更加有序，且陽性細胞數量有所增加；D組突觸間隙更為清晰，SYN陽性細胞數量和突出間隙排列結構都接近于A組；見圖5。

1：A組；2：B組；3：C組；4：D組。

圖4 各組大鼠海馬CA1區BDNF、TrkB、SYP蛋白表達水平

A：A組；B：B組；C：C組；D：D組。

圖5 光鏡下突觸素觀察結果(×400)

3 討 論

目前已證實骨髓內含量大量干細胞，其中BMSC能夠定向分化為成骨細胞、脂肪細胞、神經元細胞等中胚層來源細胞[10]。BMSC取材簡單、培養方便、具有弱免疫原性等特點，被認為是理想的干細胞。Park等[11]對缺血性腦損傷大鼠移植BMSC，結果顯示大鼠損傷腦組織血管重新生成，部分腦組織也得以重塑。但是BMSC存在分化能力容易喪失、過度老化、增值不穩定等情況。Veronesi等[12]學者對BMSC的生物學現象進行研究，最終提出BMSC多種生物學功能均與端粒酶活性有關，特別是其神經保護功能的效果與端粒酶活性呈明顯正相關。端粒酶是核糖核蛋白酶的一種，在調節染色體的復制中發揮重要作用[13-14]。本研究亦證實經過端粒酶逆轉錄酶轉染能夠使BMSC獲得更高的端粒酶活性，這對于提高BMSC的增殖速度、預防BMSC過度衰老凋亡具有重要作用。Jiang等[15]也證實將慢病毒攜帶的VEGF轉染至BMSC，BMSC的新生血管的形成和自身的增殖能夠顯著增強。

本研究對VD大鼠注射TERT轉染的BMSC，結果顯示轉染BMSC組逃避潛伏期顯著長于常規BMSC組，第一象限停留時間顯著少于常規BMSC組，說明相比較于普通BMSC替代治療，TERT轉染的BMSC治療VD后大鼠學習、記憶能夠改善更為明顯。Baranova等[16]證實BMSC能夠抑制興奮性氨基酸所產生的細胞毒作用，使突觸傳遞功能重新恢復，從而改善因神經元損傷所引起的學習、記憶功能損害。Kishi等[17]證實BNDF是保護神經細胞的主要營養因子，敲除BNDF基因后大鼠發生VD的風險顯著升高。BNDF發揮相應的作用有賴于與其特異性受體TrkB結合；Yasutake等[18]報道BNDF首先在組織中合成，然后順軸突運輸至突觸間隙，并與間隙中受體TrkB結合，從而參與神經元細胞的增殖、分化，并對損傷的神經元有恢復作用。本研究亦證實轉染BMSC組BDNF、TrkB表達水平顯著高于常規BMSC組，提示轉染BMSC對神經元的修復作用與增強BDNF、TrkB表達有關。

Schroeter等[19]稱通過觀察突觸結構的變化能夠反映出突觸結構的可塑性。SYN是神經元突觸前的特異性生物學標志物，能夠促進多種神經遞質的釋放，還能調節突觸傳遞效能；而突觸素是反映突觸數量、密度和分布的指標之一[20]。本研究顯示轉染BMSC組SYN表達水平顯著高于常規BMSC組，電鏡下觀察轉染BMSC組突觸間隙更為清晰，SYN陽性細胞數量和突出間隙排列結構都接近于陰性對照組，說明移植轉染BMSC能夠透過血腦屏障，從而促進神經細胞的生長，并誘導和產生新生軸突和樹突，證實轉染BMSC能顯著改善VD動大鼠海馬CA1區突觸可塑性，這亦是治療VD的生物學基礎。

綜上所述，相比于普通BMSC替代治療，TERT轉染BMSC對血管性癡呆大鼠的治療作用明顯，其作用機制與促進BDNF、TrkB表達、改善突觸的可塑性有關。然而神經元損傷修復的作用機制是個復雜過程，包括各種酶、鈣離子通道以及NMDAR1的磷酸化過程等，因此對其具體作用機制尚待進一步研究。

[1]Meguro K,Tanaka N,Nakatsuka M,et al.Vascular lesions in mixed dementia,vascular dementia,and Alzheimer′s disease with cerebrovascular disease:the Kurihara Project[J].J Neurol Sci,2012,322(1/2):157-160.

[2]Meguro K,Akanuma K,Meguro M,et al.Prognosis of vascular mild cognitive impairment includes vascular dementia onset and death by cardiovascular disease:reanalysis from the Osaki-Tajiri project[J].J Stroke Cerebrovasc Dis,2012,21(7):607-611.

[3]Kawakatsu M,Urata Y,Goto S,et al.Placental extract protects bone marrow-derived stem/progenitor cells against radiation injury through anti-inflammatory activity[J].J Radiat Res,2013,54(2):268-276.

[4]Zhong Y,Xu J,Deng M,et al.Generation of a human bone marrow-derived mesenchymal stem cell line expressing and secreting high levels of bioactive α-melanocyte-stimulating hormone[J].J Biochem,2013,153(4):371-379.

[5]Ding J,Cheng Y,Gao S,et al.Effects of nerve growth factor and Noggin-modified bone marrow stromal cells on stroke in rats[J].J Neurosci Res,2011,89(2):222-230.

[6]Etgen T,Hochreiter M,Kiechle V.Subclavian-axillary graft plus graft-carotid interposition in symptomatic radiation-induced occlusion of bilateral subclavian and common carotid arteries[J].Vasa,2013,42(3):223-226.

[7]Gordan ML,Jungwirth B,Ohl F,et al.Evaluation of neurobehavioral deficits following different severities of cerebral ischemia in rats:a comparison between the modified hole board test and the Morris water maze test[J].Behav Brain Res,2012,235(1):7-20.

[8]Alam JJ.Selective Brain-targeted antagonism of p38 MAPKα reduces hippocampal IL-1β levels and improves morris water maze performance in aged rats[J].J Alzheimer′s Dis,2015,48(1):219-227.

[9]Fridgeirsdottir GA,Hillered L,Clausen F.Escalated handling of young C57BL/6 mice results in altered Morris water maze performance[J].Ups J Med Sci,2014,119(1):1-9.

[10]Togami W,Sei A,Okada T,et al.Effects of water-holding capability of the PVF sponge on the adhesion and differentiation of rat bone marrow stem cell culture[J].J Biomed Mater Res A,2014,102(1):247-253.

[11]Park SY,Yoon H,Lee N,et al.Analysis of cerebral blood flow with single photon emission computed tomography in mild subcortical ischemic vascular dementia[J].Nucl Med Mol Imaging (2010),2014,48(4):272-277.

[12]Veronesi E,Murgia A,Caselli A,et al.Transportation conditions for prompt use of ex vivo expanded and freshly harvested clinical-grade bone marrow mesenchymal stromal/stem cells for bone regeneration[J].Tissue Eng Part C Methods,2014,20(3):239-251.

[13]Raichlin S,Sharon E,Freeman R,et al.Electron-transfer quenching of nucleic acid-functionalized CdSe/ZnS quantum dots by doxorubicin:a versatile system for the optical detection of DNA,aptamer-substrate complexes and telomerase activity[J].Biosens Bioelectron,2011,26(12):4681-4689.

[14]Holmstrom ED,Nesbitt DJ.Single-molecule fluorescence resonance energy transfer studies of the human telomerase RNA pseudoknot:temperature-/urea-dependent folding kinetics and thermodynamics[J].J Phys Chem B,2014,118(14):3853-3863.

[15]Jiang Y,Chen L,Tang Y,et al.HO-1 gene overexpression enhances the beneficial effects of superparamagnetic Iron oxide labeled bone marrow stromal cells transplantation in swine hearts underwent ischemia/reperfusion:an MRI study[J].Basic Res Cardiol,2010,105(3):431-442.

[16]Baranova O,Miranda LF,Pichiule P,et al.Neuron-specific inactivation of the hypoxia inducible factor 1 alpha increases brain injury in a mouse model of transient focal cerebral ischemia[J].J Neurosci,2007,27(23):6320-6332.

[17]Kishi T,Hirooka Y,Sunagawa K.Telmisartan protects against cognitive decline via up-regulation of brain-derived neurotrophic factor/tropomyosin-related kinase B in hippocampus of hypertensive rats[J].J Cardiol,2012,60(6):489-494.

[18]Yasutake C,Kuroda K,Yanagawa T,et al.Serum BDNF,TNF-alpha and IL-1beta levels in dementia patients:comparison between Alzheimer′s disease and vascular dementia[J].Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci,2006,256(7):402-406.

[19] Schroeter A,Wen S,M?lders A,et al.Depletion of the AMPAR reserve pool impairs synaptic plasticity in a model of hepatic encephalopathy[J].Mol Cell Neurosci,2015,68:331-339.

[20]Elliott T.The mean time to Express synaptic plasticity in integrate-and-express,stochastic models of synaptic plasticity induction[J].Neural Comput,2011,23(1):124-159.

Effect of TERT gene transfected BMSC on memory function and hippocampal CA1 region synaptic plasticity in vascular dementia rat*

DuanJinqi1,MaLiqiong2,LiuYuanlin1,RenWei1,ChenYuanyuan1，LiChunyan3

(1.MedicalCollegeofZhangjiakouUniversity，Zhangjiakou,Hebei075000,China;2.DepartmentofIntensiveCareMedicine,251HospitalofPLA，Zhangjiakou,Hebei075000,China;3.DepartmentofNeurology,SecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050000,China)

Objective To explore the effect of telomerase reverse transcriptase(TERT) gene transfected bone marrow stem cell(BMSC)on the memory function and hippocampal CA1 region synaptic plasticity in vascular dementia rat.Methods A total of 60 rats were randomly divided into the negative control group(group A),model group(group B),conventional BMSC group(group C) and transfected BMSC group(group D).The related indicators in each group were detected by using the Morris maze test,RT-PCR and Western blot respectively.Results The escape latency period in the group C and group D was significantly longer than that in the group B,which in the group D was significantly longer than that in the group C.Compared with the group A,the expressions of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)mRNA,TERT mRNA,SYP mRNA and protein in the group B,group C and group D were significantly decreased.The synaptic cleft arrange in group A was clear with more SYN positive cells.The synaptic cleft in the group D was clearer,and the number of SYN positive cells was close to that in group A.Conclusion TERT transfected BMSC has obvious therapeutic effect on vascular dementia rats and its mechanism may be related to the promotion of BDNF,TrkB expression and the improvement of synaptic plasticity.

telomerase reverse transcriptase;bone marrow stromal stem cells;dementia,vascular;memory function;synaptic;plasticity

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.10.002

國家自然科學基金資助項目(81171210)。 作者簡介： 段金旗(1975-)，副教授，本科，主要從事急救醫學教學工作。

R743.9

A

1671-8348(2017)10-1300-04

2016-10-26

2017-01-21)