C型鈉尿肽對腎缺血再灌注大鼠腎功能和腎組織細胞凋亡的影響及機制

樸敏虎，金秀男，李香丹，崔逢德，許東元

(1延邊大學附屬醫(yī)院，吉林延吉133000；2延邊大學醫(yī)學院)

C型鈉尿肽對腎缺血再灌注大鼠腎功能和腎組織細胞凋亡的影響及機制

樸敏虎1，金秀男1，李香丹2，崔逢德2，許東元2

(1延邊大學附屬醫(yī)院，吉林延吉133000；2延邊大學醫(yī)學院)

目的 觀察C型鈉尿肽(CNP)對腎缺血再灌注損傷大鼠腎功能、腎組織細胞凋亡的影響，并探討其機制。方法 將24只雄性Wistrar大鼠隨機分為Sham組、IR組和CNP組，每組8只。各組大鼠均摘除左側腎臟，IR組和CNP組用無創(chuàng)性小血管夾夾閉右腎動靜脈，45 min后取下血管夾恢復腎臟血供，并分別于夾閉右腎動靜脈的同時即刻持續(xù)緩慢輸注生理鹽水約2 mL、CNP 0.2 μmol/(kg·min) 至再灌注2 h；Sham組不夾閉右腎動靜脈。再灌注24 h后取血測定血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)，取右腎以ELISA法測定腎組織環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)，TUNEL染色檢測腎臟織的凋亡細胞，Western blot法檢測腎臟組織蛋白激酶B(Akt) 和β糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)蛋白及其磷酸化蛋白。結果 與Sham組比較，IR組大鼠血清Cr和BUN水平均升高(P均<0.01)，腎組織cGMP濃度降低、細胞凋亡率升高(P均<0.05)，腎組織中Akt、GSK-3 蛋白磷酸化水平均降低(P均<0.01)；與IR組比較，CNP組大鼠血清Cr和BUN水平均降低(P均<0.05)，腎組織cGMP濃度升高、細胞凋亡率降低(P均<0.05)，腎組織中Akt、GSK-3 蛋白磷酸化水平均升高(P均<0.01)。結論 CNP減輕腎臟缺血再灌注大鼠腎功能損傷及腎臟組織細胞凋亡，其機制可能與提高腎組織cGMP水平，進而提高Akt和GSK-3β蛋白磷酸化有關。

急性腎功能衰竭；缺血再灌注；C型鈉尿肽；腎功能；細胞凋亡；蛋白激酶B；糖原合成酶激酶3β；大鼠

腎缺血再灌注損傷是急性腎功能衰竭的主要原因之一，也是腎移手術、失血和休克時發(fā)生的并發(fā)癥。已有研究[1]表明，隨著腎臟血流恢復導致氧化應激繼發(fā)的細胞凋亡是腎缺血再灌注損傷的重要因素。PI3K/Akt信號通路是重要的細胞內信號轉導通路，該通路失活可增加缺血再灌注引起的腎組織損傷[2,3]。糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)在組織保護中起重要的作用，Akt活化后通過調節(jié)其下游的GSK-3β蛋白磷酸化抑制細胞凋亡。C型鈉尿肽(CNP)是重要的鈉尿肽家族成員，通過環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)/蛋白激酶G(PKG)信號通路發(fā)揮生物學效能。我們前期研究發(fā)現(xiàn)CNP可有效減輕缺血再灌注損傷的腎組織氧化應激反應[4]，但是其對腎組織細胞凋亡的影響及機制尚不清楚。2014年9月～2016年6月，我們觀察了CNP對腎缺血再灌注損傷大鼠腎功能、腎組織細胞凋亡及Akt和GSK-3β蛋白磷酸化的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康Wistar雄性大鼠，200～250 g，清潔級，購于延邊大學實驗動物中心；CNP為Sigma公司產品，全自動生化分析儀(日立7150),cGMP測試盒為R&D公司產品，TUNEL試劑盒購于Promega公司，蛋白抗體Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、β-actin購于Santa Cruz公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及造模處理 將24只大鼠隨機分為Sham組、IR組和CNP組，每組8只。用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，分離右側股靜脈并插管以備靜脈輸液。于背側正中切開約2 cm，剝離、摘除左腎避免健側代償，分離右腎動脈、靜脈。IR組和CNP組用無創(chuàng)性小血管夾夾閉右腎動靜脈，45 min后取下血管夾恢復腎臟血供，并于夾閉右腎動靜脈的同時分別持續(xù)緩慢輸注生理鹽水2 mL、CNP 0.2 μmol/(kg·min) 至再灌注2 h；Sham組不夾閉右腎動靜脈。腎組織由動脈夾閉后顏色變暗而再灌注后變紅視為缺血再灌注模型制備成功。

1.2.2 血清BUN、Cr檢測 再灌注24 h后，各組大鼠腹主動脈采血；以3 500 r/min離心15 min，取上清，用全自動生化分析儀檢測血清BUN、Cr。

1.2.3 腎組織cGMP檢測 采血后取右腎，參考文獻[5]提取腎組織中cGMP,ELISA法測定cGMP。

1.2.4 腎組織細胞凋亡觀察 4%多聚甲醛固定包埋，制備石蠟切片；按TUNEL試劑盒說明書染色，熒光顯微鏡下觀察陽性細胞，計算細胞凋亡率。

1.2.5 腎組織Akt和GSK-3β蛋白磷酸化檢測 取凍存的腎組織約100 mg，添加細胞裂解緩沖液和苯甲磺酰氟后充分勻漿，4 ℃下靜置30 min；經100 ℃煮沸5 min變性，迅速轉移到4 ℃環(huán)境下靜置1～2 min；以13 000 r/min離心10 min后取上清液，用BCA試劑通過比色法進行蛋白定量。提取的蛋白質經SDS-PAEG膠分離后，轉移到聚偏二氟乙烯膜上；加入相關一抗Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、β-actin，4 ℃孵育過夜；經辣根過氧化物酶孵育2 h后，用ECM試劑盒在暗室爆光。采用IPP軟件測量條帶灰度值，以目的條帶與β-actin條帶的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量，以p-Akt/Akt、p-GSK-3 /GSK-3 表示Akt和GSK-3β蛋白磷酸化水平。

2 結果

2.1 各組大鼠血清Cr和BUN水平比較 見表1。

表1 各組大鼠血清Cr和BUN水平比較

注：與Sham組比較，*P<0.01；與IR組比較，#P<0.05。

2.2 各組大鼠腎組織cGMP濃度和細胞凋亡率比較 見表2。

表2 各組大鼠腎組織cGMP濃度和細胞 凋亡率比較

注：與Sham組比較，*P<0.05；與IR組比較，#P<0.05。

2.3 各組大鼠腎組織中Akt、GSK-3 蛋白磷酸化水平比較 見表3。

3 討論

腎臟為高灌注器官，對缺血非常敏感，極易受到損傷。腎缺血再灌注損傷引起的病理改變主要表現(xiàn) 為皮髓質交界部的腎小管細胞發(fā)生凋亡，因此認為腎小管上皮細胞凋亡是缺血再灌注后引起腎小管壞死的一個重要原因。CNP作為鈉尿肽家族，通過自分泌或旁分泌作用于血管及相關組織。CNP廣泛分布在腎組織中，Terada等[6]用RT-PCR檢測到CNP mRNA在腎臟中有表達，Suzuki等[7]用實驗證實了正常生理狀態(tài)下的鼠腎實質以及血管內皮細胞、巨噬細胞等均可產生CNP。CNP在功能性腎臟衰竭患者尿液中增加，且尿液CNP濃度與血肌酐水平呈正相關[8]，提示CNP與腎功能衰竭關系密切。本研究發(fā)現(xiàn)，應用CNP能夠降低大鼠血清BUN和Cr水平，抑制腎組織細胞凋亡，提示CNP可抑制腎缺血再灌注引起的腎組織細胞凋亡。cGMP是細胞內第二信使，通過細胞膜上的cGMP門控離子通道、cGMP依賴性的磷酸二酯酶及蛋白激酶G(PKG)，參與血管擴張和緩解血壓等。CNP主要與其受體NPRB結合后,活化鳥苷酸環(huán)化酶，增加體內cGMP的生成，cGMP進一步作用于下游的PKG參與減輕組織損傷。研究表明，cGMP/PKG信號通路保護缺血再灌注損傷的機制之一是抑制細胞凋亡。姚建等[9]應用不同濃度的ANP、BNP、CNP刺激系膜細胞，觀察系膜細胞產生cGMP的量，發(fā)現(xiàn)生成cGMP的能力依次為CNP>ANP≥BNP。本實驗結果顯示，CNP能有效提高腎組織中cGMP水平，與IR組相比，CNP組的腎組織細胞凋亡率明顯降低，提示CNP可激活cGMP/PKG信號通路抑制細胞凋亡。

表3各組大鼠腎組織中Akt、GSK-3 蛋白磷酸化 水平比較

注：與Sham組比較，*P<0.05；與IR組比較，#P<0.05。

PI3K/Akt信號通路的激活通過調控胞內鈣濃度、線粒體膜穩(wěn)定性以及細胞凋亡發(fā)揮組織細胞保護作用，多種生物活性因子通過此信號途徑的激活發(fā)揮保護作用[10,11]。研究表明，PI3K/Akt 信號途徑的激活在保護缺血后再灌注引起的心、肝和腎等多種組織的損傷中發(fā)揮重要作用[12～14]。Akt是一種絲氨酸或蘇氨酸蛋白激酶，磷酸化后被激活的Akt發(fā)揮廣泛的生物學效應，在組織缺血后的適應中對細胞存活和凋亡中起重要作用。GSK-3β是絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，在控制細胞凋亡信號通路上有重要作用。研究[15]表明，cGMP/PKG信號通路的激活與PI3K/Akt 通路的激活有關，而GSK-3β是PI3K/Akt 的下游底物。因此，GSK-3β也可能是cGMP /PKG 信號通路的作用底物。本研究觀察到CNP組與IR組相比，Akt和GSK-3β蛋白磷酸化明顯增高，提示CNP通過cGMP/PKG信號通路促進Akt和GSK-3β磷酸化，而Akt/GSK-3β是CNP抑制腎缺血再灌注損傷的重要信號途徑之一。

綜上所述，CNP 具有抑制腎缺血再灌注大鼠腎組織細胞凋亡、改善腎功能的作用。其機制可能與提高腎組織cGMP水平，進而有效提高Akt和GSK-3β蛋白磷酸化有關。

[1] Zhong D, Wang H, Liu M, et al. Ganoderma lucidum polysaccharide peptide prevents renal ischemia reperfusion injury via counteracting oxidative stress[J]. Sci Rep, 2015,5:16910.

[2] Liu HB, Meng QH, Huang C, et al. Nephroprotective effects of polydatin against ischemia/reperfu- sion injury: a role for the PI3K/Akt signal pathway[J]. Oxid Med Cell Longev, 2015,2015:362158.

[3] Salaru DL, Arsenescu-Georgescu C, Chatzikyrkou C, et al. Midkine, a heparin-binding growth factor, and its roles in atherogenesis and inflammatory kidney diseases[J]. Nephrol Dial Transplant, 2016,31 (11):1781-1787.

[4] 金秀男,丁大植,陳英,等.CNP預處理對大鼠腎缺血再灌注損傷的影響及機制探討[J].山東醫(yī)藥,2011,51(22)：30-31.

[5] Jin X, Zhang Y, Li X, et al. C-type natriuretic peptide ameliorates ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury by inhibiting apoptosis and oxidative stress in rats[J]. Life Sci, 2014,117(1):40-45.

[6] Terada Y, Tomita K, Nonoguchi H, et al. PCR localization of C-type natriuretic peptide and B-type receptor mRNAs in rat nephron segments[J]. Am J Physiol, 1994,267(2 Pt 2):215-222.

[7] Suzuki E, Hirata Y, Hayakawa H, et al. Evidence for C-type natriuretic peptide production in the rat kidney[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1993,192(2):532-538.

[8] Gülberg V, MUller S, Henriksen JH, et al. Increased renal production of C-type natriuretic peptide (CNP) in patients with cirrhosis and functional renal failure[J]. Gut, 2000,47(6):852-857.

[9] 姚建，曹紅娣，王偉.人腎小球系膜細胞利鈉肽受體表達的研究[J].上海第二醫(yī)科大學學報,1998,18(17):479-480.

[10] Zhu Yi, Pereira Renata O, O′Neill Brian T, et al. Cardiac PI3K-Akt impairs insulin-stimulated glucose uptake independent of mTORC1 and GLUT4 translocation[J]. Mol Endocrinol, 2012,27(1):172-184.

[11] 朱美霞,劉曉霞,康婭,等.羅布麻總黃酮通過PI3K/Akt/GSK3β抑制H2O2誘導的EA.hy926 凋亡機制研究[J].生命科學研究,2016,20(2):145-152.

[12] Yao H, Han X, Han X. The cardioprotection of the insulin-mediated PI3K/Akt/mTOR signaling pathway[J]. Am J Cardiovasc Drugs, 2014,14(6):433-442.

[13] 楊牟,王濤,張居文,等.缺血后適應信號通路的研究進展[J].青島大學醫(yī)學院學報,2014,50(1)：89-91.

[14] 朱敏杰,郝海英,陳潔,等.葛根素對腎缺血再灌注大鼠腎臟組織細胞凋亡的影響及其機制探討[J].中國實驗方劑學雜志,2016,22(23)：127-132.

[15] Xu Z, Lee S, Han J. Dual role of cyclic GMP in cardiac cell survival[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2013,45(8):1577-1584.

Effects of CNP on renal function and renal apoptosis in rats withrenal ischemia-reperfusion injury

PIAOMinhu1,JINXiunan,LIXiangdan,CUIFengde,XUDongyuan

(1AffiliatedHospitalofYanbianUniversity,Yanji133000,China)

Objective To observe the effects of C-type natriuretic peptide (CNP) on renal function and renal tissue apoptosis in rats with renal ischemia-reperfusion (IR) injury and its mechanisms involved. Methods Twenty-four male Wistrar rats were randomly divided into the Sham group, IR group and CNP group (n=8). All the rats were left unilaterally nephrectomized. In the IR group and CNP group, we nipped the right renal artery and vein with noninvasive small vascular clip for 45 min. CNP [0.2 μg/(kg·min)] and 2 mL physiological saline was infused immediately and slowly at the start of a 45-min renal ischemia for 2 h in the two groups, respectively. The right renal artery and vein in the Sham group was not treated by the clip. Rats were killed to obtain the blood at 24 h after I/R. The serum creatinine (Cr) and urea nitrogen (BUN) was measured, cyclic guanosine monophosphate (cGMP) in right renal tissues was measured by ELISA, and the apoptotic cells in kidney tissues was detected by TUNEL staining. The renal tissue protein kinase B (Akt), β glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) protein and their phosphorylated protein was measured by Western blotting. Results Compared with the Sham group, the levels of serum Cr and BUN were significantly increased (bothP<0.01), the concentration of cGMP in renal tissues was decreased, and the apoptosis rate was increased (bothP<0.05), the protein phosphorylation levels of Akt and GSK-3β in the renal tissues were decreased in the IR group (bothP<0.05). Compared with the IR group, the levels of serum Cr and BUN were decreased (bothP<0.05), the concentration of cGMP was increased in the renal tissues and the apoptosis rate was decreased (bothP<0.05), the protein phosphorylation levels of Akt and GSK-3β in renal tissues were increased in the CNP group (bothP<0.01). Conclusions CNP can alleviate IR-induced kidney injury and renal tissue apoptosis. The mechanism may be related to the increased renal tissue cGMP levels which effectively increase Akt and GSK-3β protein phosphorylation.

acute kidney injury; ischemia-reperfusion; C-type natriuretic peptide; renal function; apoptosis; protein kinase B; glycogen synthase kinase-3β; rats

國家自然科學基金資助項目(81460056)。

樸敏虎(1977-)，男，博士研究生，主要研究方向為繼發(fā)性腎臟疾病的診治。 E-mail：piaominhu99@163.com

許東元(1974-)，男，副教授，主要研究方向為信號通路與疾病。E-mail： dyxu@ybu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.18.007

R692

A

1002-266X(2017)18-0023-03

2016-11-12)