高選擇性肼比率熒光探針的設計合成及分析應用

侯明萱，柳彩云

(1.山東省實驗中學，山東 濟南 250001；2.濟南大學，山東 濟南 250001)

高選擇性肼比率熒光探針的設計合成及分析應用

侯明萱1，柳彩云2

(1.山東省實驗中學，山東 濟南 250001；2.濟南大學，山東 濟南 250001)

文章為建立簡便而準確的測定肼的方法，設計合成了一個以4-溴丁酸酯作為識別受體的萘酰亞胺類肼比率熒光探針。該探針能夠利用比率熒光光譜法準確定量分析0～50 μM濃度肼，其檢出限為0.3 μM。另外，它還具有快速響應、高的選擇性和抗干擾能力強等優點，為準確定量測定肼提供了一種新的分析方法。

熒光探針；比率測定；肼；4-溴丁酸酯；萘酰亞胺

1 引言

肼作為一種重要的工業試劑廣泛應用在藥物和紡織染料等化合物的合成中。然而，肼易滲透皮膚組織或經口腔進入人體，破壞組織器官和神經系統[1]。美國環保署規定肼的閾值為10 ppb(0.31 μM)[2]。我國國家環境標準規定地面水和漁業水中肼的最高允許質量濃度10.0 μg/L。鑒于此，發展能夠有效檢測特別是能夠在生理水平條件下檢測肼的分析方法是極其重要和有意義的。

肼的檢測方法很多，如：氣相色譜法、高效液相色譜法和電化學檢測等，但是，這些方法設備昂貴，操作繁瑣。熒光光譜分析法因其具有靈敏度高、方便快捷等特點深受關注[3]。但大多熒光探針都是單一的熒光增強或者猝滅，易受到探針分布、測定環境、儀器穩定性等因素的影響。比率熒光分析法是利用熒光探針本身的發射波長處的熒光強度和與待測物反應后在另一發射波長處的熒光強度的比值作為檢測信號來檢測物質的一種方法。由于比率熒光探針以兩個波長處熒光強度的比值作為信號參量，可以減少上述影響，進而提高了測定準確性，在一定程度上解決了傳統采集單一波長信號的探針分子存在的缺陷[4]。

4-羥基-1，8-萘酰亞胺熒光團因其具有強的推拉電子體系而被廣泛應用于比率熒光探針的設計中[5]；此外，已有的研究表明4-溴丁酸酯是一個理想的肼識別受體[6]。于是，設計合成了N-丁基-4-(4-溴丁酸酯基)-1，8-萘酰亞胺化合物作為肼比率熒光探針(如圖1)。實驗結果表明：該探針能夠利用比率熒光光譜法準確定量分析0～50 μM濃度肼，其檢測限為0.3 μM。另外，它還具有快速響應、高的選擇性和抗干擾能力。

2 試驗部分

2.1 儀器與方法

所用試劑均從供應商處購買和使用，無需進一步純化。使用布魯克AV-400核磁共振儀測定探針化合物的1H-NMR和13C-NMR(溶劑用氘代氯仿，四甲基硅烷作為內標)。使用硅膠(200目～300 目，青島海陽化工有限公司)進行柱色譜分離。運用珀金-埃爾默LS-55型熒光光譜儀測定熒光發射光譜。用pH計PB-10測定pH值。

2.2 探針的合成與結構表征

將269 mg(1.0 mmol)4-羥基-1，8-萘酰亞胺和215 mg(1.3 mmol)4-溴丁酸溶于15 mL二氯甲烷中，加入97.6 mg DMAP (4-二甲氨基吡啶)、329.6 mg DCC (二環己基碳二亞胺)作為反應的催化劑，然后室溫攪拌6 h，之后旋蒸得到粗產品，最后使用二氯甲烷體系進行柱色譜分離，得到黃色純凈產品371 mg，產率為89%。

圖1 肼比率熒光探針的合成路線

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (*10-6): 0.965(t, J = 7.4 Hz, 3H), 1.405-1.462(m, 2H), 1.658-1.717(m, 2H), 2.346-2.413(m, 2H), 3.021(t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.597(t, J = 6.2 Hz, 2H), 4.161(t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.549(d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.771(t, J = 7.8 Hz, 1H), 8.225(d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.575-8.619(m, 2H).13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ (*10-6): 13.92, 20.43, 27.39, 30.24, 32.53, 40.33, 68.58, 119.40, 120.54, 123.01, 125.12, 127.36, 127.55, 129.33, 131.69, 151.28, 163.46, 164.01, 170.43, 177.80.

2.3 光譜分析的步驟

用乙醇作溶劑配制濃度為1 mM的探針和胺類化合物儲備液。用超純水作溶劑制備1 mM的水合肼母液和其他分析物溶液。用移液槍移取50 μL探針儲備液加入各個比色管中作為測試溶液，然后稀釋溶液至10 mL，溶液體系用無水乙醇和超純水(3:7，v/v)且含有磷酸鹽緩沖溶液(5 mM，pH值為7.4)。所有的測試均在25℃下完成。使用石英比色皿(徑長為1 cm)進行樣品熒光光譜的測定。

3 結果與討論

3.1 響應時間的測定

在本文中，測定體系選擇的是乙醇和水(3∶7, v/v)，探針濃度為5 μM。此外，為避免溶液中pH變化引起的影響，加入濃度為5 mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH值為7.4)。

探針的響應時間是探針測試性能的重要參數，探針對肼響應時間的測試是在室溫25℃下進行的。如圖2所示，探針在452 nm和547 nm處的熒光強度的比值隨反應的進行逐漸降低，響應時間約為20 min時基本保持不變。結果表明，探針對水合肼響應時間約為20 min，其響應速率比已報道的大多數熒光探針快[7-9]。因此，下面的測試選用20 min作為測定時間。

圖2 探針(5μM)對肼(100μM)響應時間的測試結果

3.2 肼的定量分析

如圖3所示，隨著肼逐漸的加入，探針在452 nm處的發射峰在逐漸下降，同時在547 nm處出現的新紅移發射峰在不斷增長。重要的是，熒光強度比率(F547/ F452)和肼濃度(0～100 μM)之間有較好的線性關系，檢出限為0.3 μM。這些結果表明，探針可以利用比率熒光光譜法對肼進行準確的靈敏分析，且能夠滿足實際需求。

圖3 不同濃度肼(0～100μM)對探針(5μM)熒光光譜的影響

3.3 肼的選擇性和抗干擾能力測定

圖4 不同分析物對探針(5μM)熒光光譜的影響

注：a-探針；b-正丁胺；c-乙二胺；d-三乙胺；e-二甲胺；f-醋酸銨；g-谷胱甘肽；h-硫離子；i-氯離子；j-碘離子；k-硫酸根離子；l-硫腈酸根；m-碳酸氫根；n-肼

圖5 不同分析物對探針(5μM)識別肼的影響

注：a-探針；b-正丁胺；c-乙二胺；d-三乙胺；e-二甲胺；f-醋酸銨；g-谷胱甘肽；h-硫離子；i-氯離子；j-碘離子；k-硫酸根離子；l-硫腈酸根；m-碳酸氫根

4 結論

本文中建立了一種簡單有效且具有高選擇性和靈敏度，能夠在水溶液中識別肼的熒光測量方法。新制備的比率熒光探針可用于環境保護、水處理和安全檢查等方面。這種比率熒光探針越來越受到廣泛的關注，同時為當前測肼熒光分子探針的設計合成提供了一種新思路。

[1] 周秋蘭，谷標，尹鵬，等.一種新型水合胼熒光比率探針的合成及應用研究[J].湖南師范大學自然科學學報，2015，38(3)：47-52.

[2] 肖亮亮.基于ESIPT機理的苯并唑類熒光探針的設計、合成與應用研究[D]. 咸陽：西北農林科技大學，2015.

[3] 張健健.基于花菁骨架近紅外熒光探針的設計及成像應用[D].蘭州：蘭州大學，2016.

[4] Hu C,Sun W.A Rationmetric Near-infrared Fluorescent Probe for Hydrazine and its in Vivo Application[J].Organic Letters,2013,15(15):4022-4025.

[5] Liu C，Wu H,Wang Z,et al.A Fast-response,Highly sensitive and Selective Fluorescent Probe for Ratiometric Imaging of Nitroxyl in Living Cells[J].Chemical Communications,2014，50(45)：6013-6016.

[6] Goswami S,Aich K,Das S,et al.Areaction based Colorimetric as well as Fluorescence“Turn on”Probe for the Rapid Detection of Hydrazine[J].RSC Advances,2014,4(27):14210-14214.

[7] 余升龍.基于香豆素和喹啉母體的小分子熒光化學傳感器的研究[D].合肥：安徽大學，2016.

[8] Zhao J，Xu Y，Li H，et al. A Facile Intracellular Fluorescent Probe for Detection of Hydrazine and its Application[J].New Journal of Chemistry，2013，37(12)：3849-3852.

[9] Sun M,Guo J,Yang Q,etal.A New Fluorescent and Colorimetric Sensor for Hydrazine and its Application in Biological Systems[J].Journal of Materials Chemistry B,2014，2(13)：1846-1851.

Designed Synthesis and Analytical Application of A Highly Selective Ratiometric Fluorescent Probe for Hydrazine

HouMingxuan1,LiuCaiyun2

(1.Shandong Experimental High School, Jinan 250001, China; 2.Jinan University, Jinan 250001, China)

In this paper, a naphthalimide-derived ratiometric fluorescent probe employing 4-bromobutanoate moiety as recognition receptor for hydrazine was designed and synthesized for developing a simple and accurate method for the detection of hydrazine. The proposed fluorescent probe can detect hydrazine accurately in the range of 0～50 μM with the detection limit of 0.3 μM through ratiometric fluorescence spectra. Additionally, this probe possessed advantages including rapid response, high selectivity and anti-interference, and will provide a new assay for accurately detecting hydrazine.

fluorescent probe; ratiometric detection; hydrazine; 4-bromobutanoate; naphthalimide

2017-01-03

侯明萱(1999—)，女，山東濟南人，高中；柳彩云，通信作者，講師，博士，stu_liucy@ujn.edu.cn。

O657.3

B

1009-3028(2017)01-0054-03