耐鎘菌株N-17的分離、鑒定及其強化印度芥菜富集土壤鎘的潛力

杜東霞，杜 宇，許 雋，尹紅梅，賀月林

(湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009)

耐鎘菌株N-17的分離、鑒定及其強化印度芥菜富集土壤鎘的潛力

杜東霞，杜 宇，許 雋，尹紅梅，賀月林*

(湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009)

從鎘污染稻田土壤中分離到一株兼具活化碳酸鎘、分泌鐵載體和固氮能力的耐鎘菌株N-17，結合菌體形態、生理生化及16S rDNA分析，初步鑒定其為伯克氏菌屬。將其用于強化印度芥菜修復鎘污染土壤，盆栽試驗結果表明，該菌株能增加污染土壤中可交換態鎘的含量，與對照相比，接種該菌后，印度芥菜的生物量提高了9.41%，株高增加了20.2%，地上部和地下部鎘含量分別比對照提高了49%和67%。

鐵載體；固氮；伯克氏菌屬；植物修復

隨著我國工業化和城市化進程的加快，環境問題日益突出。根據2014年4月環保部和國土資源部聯合發布的《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，全國耕地土壤污染物點位超標率19.4%，污染類型以無機型為主，無機污染物超標點位數占全部超標點位的82.8%，主要無機污染物包括鎘(Cd)、汞(Hg)、砷(As)、銅(Cu)、鉛(Pb)、鉻(Cr)、鋅(Zn)、鎳(Ni)等重金屬，點位超標率分別為7.0%、1.6%、2.7%、2.1%、1.5%、1.1%、0.9%、4.8%。以目前全國糧食播種面積1.35億hm2推算，有待修復的耕地污染面積約為0.26億hm2[1-2]。如何修復并提高重金屬污染土壤的生產力，已成為事關我國農業可持續發展和環境質量改善的研究熱點。

傳統的物理、化學修復方法大都存在修復成本高、環境風險大、破壞土壤結構、降低土壤生物活性和土壤肥力等缺點。1983年Chaney最早提出了植物修復的概念[3]。但單一應用植物修復技術會受到植物生物量、生長速度、土壤理化性質及污染物在土壤中的分布和生物利用度等條件的限制，導致其在生產上的推廣應用進展緩慢[4]。

微生物，特別是細菌，比表面積大，數量多，代謝活動旺盛，在重金屬污染土壤修復方面具有獨特的作用，不僅可通過自身吸附累積重金屬，還可通過分泌鐵載體、功能酶、有機酸及生物表面活性劑等物質活化土壤重金屬，促進植物吸收重金屬。微生物與超積累植物的聯合修復能充分利用其共生關系，發揮各自優勢，協同增效，達到高效修復重金屬污染土壤的目的[5-8]。Dimkpa等[9]發現鏈霉菌tendae F4產生的鐵載體能顯著增強向日葵對鎘的吸收能力。吳秉奇等[10]從鎘超積累龍葵葉片中篩選到一株內生細菌DE5，結果表明，接種DE5能夠強化青葙的鎘吸收效果，其作用效果好于澆施螯合劑EDTA。

本研究從重金屬污染土壤中分離到1株兼具活化碳酸鎘、分泌鐵載體和固氮能力的多功能鎘耐性菌株N-17，該菌株能夠和超累積植物印度芥菜共生，并通過促生長(固氮作用)、活化鎘(分泌鐵載體和有機酸等)等作用提高印度芥菜的修復效率，以期為植物-微生物聯合修復重金屬污染土壤的大面積應用提供理論依據和試驗材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物，印度芥菜(Brassicajuncea)。盆栽用土采自岳陽縣某鎮中輕度鎘污染稻田0～20 cm土層，晾干過篩后使用，土壤有機質含量37.2 g·kg-1，鎘含量2.33 mg·kg-1，堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別為180.0、12.9、58.0 mg·kg-1。篩菌用土采自株洲市清水塘工業區某冶煉廠附近0～20 cm土層，保存于無菌紙袋中，帶回實驗室供菌株分離、篩選，土壤有機質含量30.8 g·kg-1，鎘含量12.0 mg·kg-1，堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別為90.5、21.2、68.9 mg·kg-1。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：原子吸收光譜儀，AA-670型，日本島津制作所生產；紫外分光光度計，751GW，惠普上海分析儀器有限公司生產；pH計，8904型，江蘇江環分析儀器有限公司生產。

主要試劑：CdCl2、Pb(NO3)2、ZnSO4、CoCl2、CuSO4、K2Cr2O7、CdCO3，均為分析純，購自上海生物工程技術服務有限公司。

Ashby無氮培養基參照文獻[11]中的配方配制；改進的MSA培養基、CAS檢測平板及CAS染液參照文獻[12]中的配方配制。

1.3 耐鎘菌株篩選及馴化

稱取10 g新鮮土壤樣品，放入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，利用常規梯度稀釋方法獲得各個梯度的土壤稀釋液，取適量分別涂布在含Cd的LB固體培養基上，待長出菌落后，參照文獻[7]中的方法進行分離純化。

將篩選到的菌株分別涂布到Cd2+含量為2、4、6、8、10 mmol·L-1的LB固體培養基上，培養后，將長勢較好的菌株接種到Cd2+含量比篩選平板高2 mmol·L-1的固體培養基上逐步馴化培養。以相同的方法逐步淘汰鎘耐性較差的菌株，記錄不同菌株的最高耐受濃度[7]。

1.4 菌株的性能測試

1.4.1 重金屬抗性測定

參照文獻[7]中的方法，將分離純化的菌株在LB液體培養基中培養至D600達0.2時，在培養液中分別加入相應濃度(設置濃度梯度)的重金屬(Cd2+、Zn2+、Co2+、Pb2+、Cr2+、Cu2+)，每個處理設置3個重復，培養24 h后，測定各個含有重金屬培養液的D600值。

1.4.2 固氮酶活測定

將純化后的耐鎘菌株轉接到固體Ashby無氮培養基，28 ℃培養4 d，挑選生長旺盛、較大、黏稠的菌落保存到斜面備用。用乙炔還原法測定所分離細菌的固氮酶活性[11]。

1.4.3 菌株產鐵載體的能力分析

將純化后的耐鎘菌株采用點接方法轉接到CAS檢測平板上，在30 ℃恒溫培養箱中培養1～7 d，每12 h觀察一次結果，根據黃色暈圈的有無及大小篩選出產鐵載體能力較強的菌株，保存留用。對篩選到的可產鐵載體的菌株，采用改進的液體MSA培養基定量測定其產鐵載體的能力[12]。

1.5 菌株16S rDNA的PCR擴增和系統發育分析

基因組DNA提取及引物設計參照文獻[13]。PCR擴增反應參照文獻[14]中的方法，并對其加以改進(PCR 反應緩沖液改用2×GC緩沖液)。PCR產物的純化和測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

通過Blast程序，將待測定的序列與GenBank數據庫中已有的16S rDNA序列進行相似性分析[15]，利用 DNAstar構建系統進化樹。

1.6 菌株對重金屬鎘的活化作用

將菌株N-17活化后制成菌懸液，以5%的接種量接入加有碳酸鎘(100 mg ·L-1)的液體培養基中，30 ℃搖床振蕩培養48 h。以加有等量去離子水的液體培養基為對照。每個處理重復3次，10 000 r·min-1離心5 min，收集上清液，測定上清液pH值及其中Cd2+濃度，計算活化率。

將菌株N-17活化后制成菌懸液，接入重金屬鎘含量為12 mg·kg-1的土壤中(篩菌用土)，使菌株的細胞數量達到2×108cfu·g-1，對照加液

體培養基，重復3次，30 ℃恒溫培養。每5 d測定1次鎘耐性菌株的數量。同時采用改進的Tessie連續浸提法，測定土壤中不同形態鎘的含量。

1.7 N-17與印度芥菜聯合土壤修復試驗

在湖南省微生物研究院網室內開展盆栽試驗，土壤類型為紫潮泥土(pH 5.2)。供試土壤經晾干、粉碎、過篩后，裝盆，每盆5 kg，按照土壤質量的1%添加N-17，以不添加N-17菌劑的為對照。每個處理重復3次，隨機排列。各處理管理措施相同。

1.8 數據處理

用SPSS 17.0軟件對數據進行整理及方差分析，采用Duncan法對有顯著差異的處理進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 菌株N-17的形態特征及生理生化特性

經篩選、馴化，本研究得到1株耐鎘菌株，將其命名為N-17。該菌株菌體呈桿狀，革蘭氏染色呈陰性，無芽孢。菌落為不規則圓形，表面光滑濕潤，易挑起，邊緣不整齊。主要生理生化特性結果詳見表1。

2.2 菌株N-17的重金屬抗性

N-17菌株對Cd2+、Zn2+、Co2+、Pb2+、Cr2+、Cu2+表現出不同的程度的抗性(圖1)，其中，對鎘的抗性最高，在LB固體培養基上最高可耐受18 mmol·L-1的鎘。

2.3 菌株N-17的固氮能力

表1 菌株N-17的生理生化試驗結果

Table 1 Physiological biochemical characteristics of strain N-17

指標Index結果Result指標Index結果Result麥芽糖發酵Maltosefermentation-葡萄糖苷水解酶Grapeglycosidestest+乳糖發酵Lactosefermentation-蛋白水解酶Proteolyticenzymetest+蔗糖發酵Sucrosefermentation-半乳糖苷酶Glucanasetest+甘露糖發酵Mannosefermentation+檸檬酸鹽試驗Citrateutilizationtest+阿拉伯糖發酵Arabiasugarfermentation+反硝化試驗Denitrificationtest+果糖發酵Fructosefermentation+甲基紅試驗Methylredtest-葡萄糖發酵Glucosefermentation+硫化氫試驗hydrogensulfideproductiontest-山梨醇發酵Sorbitolfermentation+明膠液化試驗Gelatinliquefactiontests-甘露醇發酵Mannitolfermentation+V?P試驗V?Ptest+脲酶試驗Ureasetest+吲哚試驗Indoletest+

+表示陽性，-表示陰性。

+indicated positive;-indicated negative.

圖1 不同重金屬對菌株N-17的最低抑菌濃度Fig.1 Minimum inhibitory concentration of N-17 strain on 6 kinds of heavy metals

菌株N-17在Ashby無氮培養基上培養48 h即可長出肉眼可見、明顯的菌落，其固氮酶活性高達216.83 nmol C2H4·mL-1·h-1。

2.4 菌株N-17產鐵載體的能力

在CAS檢測平板上，N-17菌株菌落周圍可產生較大的黃色水解圈(圖2)。定量分析結果表明，其鐵載體表達量高達83.4%。

2.5 菌株N-17的16S rDNA序列及系統發育分析

菌株N-17的16S rDNA序列擴增長度為1.4 kb。將測序得到的序列進行Blast序列分析和同源性比較，并將其與同源性最高的9株細菌的16S rDNA全序列構建系統發育樹(圖3)。綜合形態學、生理生化試驗，以及分子鑒定結果，可初步判定該菌株為伯克氏菌屬。

2.6 菌株N-17對鎘的活化能力

圖2 菌株N-17產鐵載體的情況Fig.2 Detection of siderophore produced by strain N-17

圖3 菌株N-17的16S rDNA序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain N-17

從表2可以看出，未接種N-17對照處理的培養液pH為7.25，接種菌株N-17的培養液pH為6.10，降低了1.15個單位。與不接菌對照相比，接種N-17菌株的培養液中有效鎘含量增加了13.9倍。

與對照相比，接種菌株N-17后，土壤中可交換態Cd含量增加30.9%，碳酸鹽結合態Cd含量增加62.6%，鐵錳結合態Cd含量降低21.1%，殘渣態Cd含量降低46.0%，有機結合態Cd含量無明顯變化(表3)。由此可見，菌株N-17有利于土壤中的鐵錳結合態和殘渣態Cd向更易被植物吸收的可交換態和碳酸鹽結合態轉化。

表2 菌株N-17對沉淀態鎘的活化作用

Table 2 Activation of Cd by strain N-17 in medium

處理Treatment培養液上清中的鎘濃度Cdconcentrationinsupernatantofculturesolution/(mg·L-1)培養液pHpHofculturesolutionN?1798 6±0 86 10±0 26對照Control6 6±0 17 25±0 13

表3 菌株N-17處理對土壤中鎘存在形態的影響

Table 3 Effects of N-17 treatments on cadmium speciation in soils (mg·kg-1)

2.7 菌株N-17對印度芥菜鎘吸收的影響

由表4可以看出，菌株N-17處理下印度芥菜生物量較對照提高了9.41%，株高增加了20.2%，且差異顯著(P<0.05)。這可能是因為接種微生物后，活化了土壤礦物中的磷、鉀等營養元素，促進了植物的生長。

與對照相比，接種菌株N-17后，印度芥菜地上部和地下部鎘含量分別比對照提高了49%和67%，整株印度芥菜的鎘積累量比對照增加55%，且差異均達顯著水平(P<0.05)(表5)。

表4 菌株N-17處理對印度芥菜生長發育的影響
Table 4 Effects of N-17 treatment on growth ofBrassicajuncea

處理Treatment株高Plantheight/cm生物量Biomass/gN?1725 32±1 20a120 21±2 0a對照Control21 06±0 50b109 87±1 2b

同列數據后無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Data followed by no same letters indicated significant difference atP<0.05. The same as below.

表5 菌株N-17處理對印度芥菜鎘吸收量的影響

Table 5 Effects of N-17 treatment on cadmium contents ofBrassicajuncea

處理Treatment地上部鎘含量Cdcontentinabovegroundpart/(mg·kg-1)地下部鎘含量Cdcontentinundergroundpart/(mg·kg-1)整株鎘積累量Cdaccumulationamountinwholeplant/(mg·kg-1)N?173 52±0 01a1 87±0 30a5 39±0 04a對照Control2 36±0 01b1 12±0 06b3 48±0 07b

3 討論

植物修復技術作為一種生物修復技術，因其原位、經濟、綠色等優點，越來越受到重金屬污染土壤修復領域的關注。土壤中微生物種類多，繁殖快，比表面積大，代謝活動旺盛，對土壤微生態環境具有重要影響。楊卓等[16]以印度芥菜作為超富集植物，研究了巨大芽孢桿菌和膠質芽孢桿菌的混合微生物制劑對植物修復重金屬污染土壤的作用。結果表明，混合微生物制劑可以促進植物的生長，增強印度芥菜對重金屬的吸收，大幅提高植物修復效率，可使印度芥菜對外源添加的Cd、Pb和Zn的提取量分別提高1.18、1.54和0.85倍。

針對當前耕地重金屬污染的長期性和復雜性，以及現有修復措施的局限性，本研究從鎘污染的稻田土壤中篩選到1株兼具活化碳酸鎘、分泌鐵載體和固氮能力的鎘耐性菌株N-17，結合菌體形態、生理生化及16S rDNA分析，該菌株初步鑒定為伯克氏菌屬。將該菌株與印度芥菜聯合開展土壤Cd污染修復。盆栽試驗結果表明，菌株N-17不僅促進了印度芥菜的生長，還促進了其地上部和地下部對鎘的積累，可使印度芥菜整株的鎘積累量增加55%。

細菌鐵載體(siderophore)是由細菌分泌的一種對Fe3+具有高度特異性結合能力的小分子蛋白質，微生物分泌的鐵載體可在植物根際復雜的土壤環境中，通過協同作用促進植物對土壤中礦質營養元素的吸收(如鐵、磷和鉀等元素)，增加土壤中重金屬鎘的可溶出性。本試驗所分離的N-17菌株具有分泌植物鐵載體的能力，這無疑有助于印度芥菜從土壤中富集更多的鎘。試驗顯示，菌株N-17可降低培養基的pH值，這可能是因為其代謝產物中含有一定量的易降解的低分子有機酸，如檸檬酸、果酸、丙二酸、酒石酸等，這些酸性物質釋放到土壤中，亦具有活化土壤中重金屬鎘的能力。這些代謝產物還可通過絡合、氧化還原等作用，改變土壤中重金屬鎘的存在形態，從而提高重金屬的生物可利用性。本試驗結果顯示，接種菌株N-17可使土壤中的鐵錳結合態和殘渣態Cd向更易被植物吸收的可交換態和碳酸鹽結合態轉化。此外，N-17菌株還具有顯著的固氮活性，印度芥菜生物量的增加也可能與該菌株的固氮活性有關。

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(責任編輯 高 峻)

Isolation， identification of a Cd-resistant strain N-17 and its potential in enhancing cadmium accumulation byBrassicajuncea

DU Dongxia， DU Yu， XU Jun， YIN Hongmei， HE Yuelin*

(HunanAcademyofMicrobiology，Changsha410009，China)

A Cd-resistant strain N-17， with siderophore-producing， nitrogen-fixing and CdCO3-solubilizing capacity， was isolated from paddy soil with Cd pollution. Combined with the colony morphology， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis， N-17 was identified asBurkholderiasp. A pot experiment was done to investigate the effect of N-17 on phytoremediation of Cd polluted soil byBrassicajuncea. It was shown that this strain could significantly increase the content of exchangeable cadmium in contaminated soil. Compared with control， the biomass and plant height ofBrassicajunceainoculated with N-17 was increased by 9.41% and 20.2%， respectively. The cadmium content in aboveground and root ofBrassicajunceainoculated with N-17 was increased by 49% and 67%, respectively.

siderophore; nitrogen-fixing capacity;Burkholderiasp.; phytoremediation

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.05.18

2017-01-09

基金專項：湖南省自然科學基金項目 (13JJ2035)；農業部、財政部“長株潭”耕地重金屬污染修復及農作物種植結構調整子項目(農辦財函〔2016〕6號)

杜東霞(1980—)，女，山東荷澤人，碩士，助理研究員，主要從事農牧廢棄物處理及農田土壤污染防控等方面的研究。E-mail: xiaxia414@126.com

*通信作者，賀月林，E-mail: 719641546@qq.com

X172

A

1004-1524(2017)05-0812-06

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(5): 812-817

杜東霞，杜宇，許雋，等. 耐鎘菌株N-17的分離、鑒定及其強化印度芥菜富集土壤鎘的潛力[J]. 浙江農業學報，2017，29(5)： 812-817.