GICA檢測登革熱病毒NS1抗原和（或）IgG/IgM抗體的臨床意義

鐘秀茵++楊曉斌++何湘鵑++黃少霞++蔡藝

[摘要]目的 分析并探討膠體金免疫層析法（GICA）檢測登革熱病毒NS1抗原和（或）IgG/IgM抗體的效果。方法 選擇我院2014年1月～2015年6月收治的1200例門診疑似登革熱病毒感染者作為研究對象，應用隨機分組法將患者分為兩組各600例，分別接受聚合酶鏈反應（PCR）熒光探針法和酶聯免疫吸附測定法（ELISA），再將上述兩類樣本分別隨機分為3份，每份200例，A組用GICA檢測NSI抗原，B組用GICA檢測IgG/IgM抗體，C組共同檢測NS1抗原和 IgG/IgM抗體。另D組選取60名健康人群使用GICA聯合檢測NS1抗原和IgG/IgM抗體。結果 ELISA組結果：A組結果與ELISA結果相比，陽性、陰性、總體符合率分別為82.88%、90.00%、83.00%，結果有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；B組結果與ELISA結果相比，陽性、陰性、總體符合率分別為88.20%、71.79%、85.00%，結果有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；C組結果與 ELISA結果相比，陽性、陰性、總體符合率分別為94.87%、47.73%、84.50%，結果無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；PCR組結果：A組結果與 PCR結果相比，陽性、陰性、總體符合率分別為87.68%、83.87%、86.50%，結果有統(tǒng)計學差異；B組結果與PCR結果相比，陽性、陰性、總體符合率分別為91.45%、85.42%、90.00%，結果有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；C組結果與 PCR結果相比，陽性、陰性、總體符合率分別為95.43%、60.00%、91.00%，結果無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；D組結果均為陰性，特異性為100%。結論 GICA對NIS抗原和IgG/IgM抗體的聯合檢測結果與ELISA和PCR檢測結果較為接近，且特異性比較好，可用于登革熱病毒感染的早期篩查和輔助診斷。

[關鍵詞]膠體金免疫層析法；酶聯免疫吸附測定法；聚合酶鏈反應；登革熱病毒

[中圖分類號] R512.82 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）04（c）-0156-04

[Abstract]Objective To analyze and explore the effect of application of colloidal gold immunochromatography assay （GICA） in the detection of Dengue virus NS1 antigen and/or IgG/IgM antibody.Methods Altogether 1200 cases of suspected Dengue virus infection patients who were treated in our hospital from January 2014 to June 2015 were involved as the object of this research and divided into two groups （PCR group and ELISA group） by using the random grouping method， with 600 casesin each group.Two groups were treated with polymerase chain reaction（PCR） fluorescence probe and enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），respectively.The two types of samples aforementioned were randomly divided into 3 sub-groups，with 200 samples in each sub-groups：GICA was used in group A to detect NSI antigen；GICA was used in group B to detect IgG/IgM antibody；it was also used in group C for detection of NS1 antigen and IgG/IgM antibody.Additionally，60 healthy volunteers were selected as Group D，whose NS1 antigen and IgG/IgM antibody were detected by using GICA.Results ELISA group results：compared with the results of ELISA group， the positive，negative and overall coincidence rate of group A were 82.88%，90.00% and 83.00%，with statistically significant difference（P<0.05）；compared with the results of ELISA group，the positive，negative and overall coincidence rate of group B were 88.20%，71.79% and 85.00%，with statistically significant difference（P<0.05）；compared with the results of ELISA Group，the positive，negative and overall coincidence rate of group A were 94.87%，47.73% and 84.50%，without statistically significant difference（P>0.05）；PCR group results：compared with the results of PCR group，the positive， negative and overall coincidence rate of group A were 87.68%， 83.87% and 86.50%，with statistically significant differenc（P<0.05）；compared with the results of PCR group，the positive，negative and overall coincidence rate of group B were 91.45%，85.42% and 90%，with statistically significant difference（P<0.05）；compared with the results of PCR Group，the positive， negative and overall coincidence rate of Group B were 95.43%，60.00% and 91.00%，without statistically significant difference（P>0.05）.The result of Group D was negative and its specificity was 100%.Conclusion The result achieved by application of GICA is close to that of ELISA and PCR in detection of NIS and IgG/IgM with good specificity.tcan be used for early screening and diagnosis of dengue virus infections.

[Key words]Colloidal gold immunochromatographic assay；Enzyme-linked immunosorbent assay；Polymerase chain reaction；Dengue virus

登革熱（dengue fever，DF）和登革熱出血熱（dengue hemorrhagic fever，DHF）是由登革熱病毒（dengue virus，DV）引起的熱帶蟲媒傳染病，DV分為4個血清型（DV1、DV2、DV3、DV4），流行于全球熱帶和亞熱帶的60多個國家和地區(qū)，以東南亞國家最為嚴重。我國40年代在東南亞沿海曾有散發(fā)流行，至1978年在廣東佛山暴發(fā)流行以來，就不斷出現登革熱暴發(fā)和流行。其中，2014年，廣東省及廣州市登革熱疫情更是出現了史無前例的大爆發(fā)流行，報告病例數將近4萬，引起了嚴重的公共衛(wèi)生問題，引起國家及社會公眾的高度關注，嚴重影響正常的社會秩序和廣大群眾的身體健康及日常生活。本研究主要擬采用GICA法和ELISA法及核酸檢測PCR法3種方法進行比較檢測登革熱病毒，對3種常用的檢測方法的實驗條件進行摸索和優(yōu)化，分析每種方法的優(yōu)缺點和適用范圍以及其各自的靈敏度和特異性等，結合疫情選擇合適的檢測方法，必要時聯合使用，使得實驗室診斷結果既快速準確，又科學高效[1-6]，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取我院2014年1月～2015年6月收治的1200例門診疑似登革熱病毒感染者作為研究對象，年齡16～60歲，平均35.8歲；男723例，女477例；文化水平：小學及以下414例，中學456例，大學及以上330例；排除有既往病史，藥物過敏史者。將患者隨機分為PCR組和ELISA組，各600例，分別采用PCR和ELISA檢測。對兩組患者進行再次分組，分別分為A、B、C三組，各200例。另選60名健康人群作為對照（D組），各組患者的年齡、性別、文化程度等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。所有實驗流程均詳情告知參與研究者并簽署知情同意書，本實驗經本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2檢測方法

PCR組和ELISA組患者分別接受PCR熒光探針法和ELISA，PCR反應條件：42℃ 8 min，95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，45個循環(huán)；退火溫度按55～60℃間隔1℃分別試驗優(yōu)化，退火溫度為60℃時，反應曲線呈典型的S型，熒光信號最強，本實驗選擇60℃作為退火溫度進行下面的所有熒光PCR反應；ELISA采用間接法。A組用GICA檢測NSI抗原，B組用GICA檢測IgG/IgM抗體，C組共同檢測NS1抗原和IgG/IgM抗體，D組使用GICA聯合檢測NS1抗原和IgG/IgM抗體。所有檢測指標均以檢出抗原或抗體為陽性，未檢出為陰性。其中DENV核酸試劑由江蘇碩世生物有限公司提供；ELISA試劑盒由澳大利亞PanBio公司提供；DENV NS1抗原和或IgG/IgM抗體檢測試劑由澳大利亞PanBio公司提供。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，計量資料組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 ELISA組中A組檢測結果

DENV NS1抗原檢測與ELISA的陽性符合率為82.88%，陰性符合率為90.00%，總體符合率為83.00%，NS1抗原檢測結果與ELISA檢測結果比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

2.2 ELISA組中B組檢測結果

IgG/IgM抗體檢測與ELISA的陽性符合率為88.20%，陰性符合率為71.79%，總體符合率為85.00%，IgG/IgM抗體檢測結果與ELISA檢測結果比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表2）。

2.3 ELISA組中C組檢測結果

DENV NS1抗原檢測聯合IgG/IgM抗體檢測與ELISA的陽性符合率為94.87%，陰性符合率為47.73%，總體符合率為84.50%，NS1抗原檢測聯合IgG/IgM抗體檢測與ELISA檢測結果比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表3）。

2.4 PCR組中A組檢測結果

DENV NS1抗原檢測與PCR的陽性符合率為87.68%，陰性符合率為83.87%，總體符合率為86.50%，NS1抗原檢測結果與PCR檢測結果比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表4）。

2.5 PCR組中B組檢測結果

IgG/IgM抗體檢測與PCR的陽性符合率為91.45%，陰性符合率為85.42%，總體符合率為90.00%，IgG/IgM抗體檢測結果與PCR檢測結果比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表5）。

2.6 PCR組中C組檢測結果

DENV NS1抗原檢測聯合IgG/IgM抗體檢測與PCR的陽性符合率為95.43%，陰性符合率為60.00%，總體符合率為91.00%，NS1抗原檢測聯合IgG/IgM抗體檢測與PCR檢測結果比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表6）。

2.7 D組檢測結果

采用GICA聯合檢測NS1抗原及IgG/IgM抗體，所得結果均為陰性，說明檢測特異性為100%，具有高特異性。

3討論

常用于登革熱抗體檢測的方法主要有血凝抑制試驗（HAI）、間接免疫熒光法（IFA）、ELISA法、免疫斑點法（DIBA）、膠體金免疫層析法（GICA）及核酸檢測PCR法等[7-11]。其中，HAI法雖然是WHO推薦的方法，但是由于其試劑和試驗操作不易標準化，操作繁瑣、檢測周期長，在基層實驗室難以開展；IFA法操作條件難以控制，非特異性反應較高，交叉反應明顯，易出現假陽性，也難在基層醫(yī)療機構建立。由于登革熱疫苗研究尚未取得突破性進展，因此，登革熱病毒進行快速檢測和分型對登革熱的臨床診斷和綜合防治有重要意義。然而，在2014年疫情暴發(fā)之前，廣州市各區(qū)疾控中心及相關醫(yī)療機構在登革熱病毒實驗室診斷方面仍缺乏檢驗經驗，方法不完善，因此建立有效的適合基層實驗室的檢測方法極其重要和迫切[12-14]。

本研究主要探索登革熱病毒檢測的實驗室診斷方法，采用GICA、ELISA法及核酸檢測PCR法3種方法檢測登革熱病毒，結合登革熱疫情的流行病學資料，為基層實驗室應對登革熱疫情提供檢測方法的參考和依據。分析檢測結果，PCR技術應用于登革熱病毒的檢測極大提高了檢測速度，重復性好，特異性高，可快速分型，為登革熱的臨床診斷提供了一種有效的手段[15]，但由于PCR技術含量高，費用昂貴，不適合基層實驗室。ELISA法檢測DV-IgM/IgG抗體敏感性和特異性較高，對檢測設備條件要求低，但檢測時間較長，適合爆發(fā)流行期間大批量標本檢測。GICA在聯合檢測NS1抗原和IgG/IgM時與ELISA法和PCR檢測結果相近，有理想的敏感性和特異性，無需特殊的儀器設備，檢測手段簡單，能快速出結果，適合于臨床的推廣應用。

[參考文獻]

[1]黃新鳳，陽帆，冼慧霞，等.深圳登革熱患者血清中2型病毒株的分離鑒定[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011，21（5）：1170-1172.

[2]王佃鵬，朱玉蘭，劉勝牙，等. 登革熱病毒多重熒光 PCR 檢測及基因分型方法的研究[J]. 熱帶醫(yī)學雜志，2012，12 （8）：936-939.

[3]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.登革熱診療指南（2014年第2版）[J].中國醫(yī)藥科學，2014，4（21）：221-224.

[4]石亞玲，趙蓉，黃穎怡.登革熱病毒快速檢測NS1抗原和IgG/IgM抗體的臨床應用評價[J].檢驗醫(yī)學，2015，4（30）：363-366.

[5]Gurukumar KR，Priyadarshini D，Patil JA，et al.Development of real time PCR for detection and quantitation of dengue viruses[J].Virol J，2009，6（1）：10.

[6]Xu h，DiB，PanYX，et al.Serotype 1-Specific monoclonal antibody-based antigen capture immunoassay for detection of circulating nonstructural protein NSI：implications for early diagnosis and serotyping of dengue virus intections[J].J Clin Microbiol，2006，44（8）：2872-2878.

[7]陳鳳華，孫建華，馬盈盈，等.實時熒光定量PCR技術在病原體快檢中的研究進展與應用[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2013，7（23）：11 004-11 006.

[8]滕娟，潘林奇，李曉杰，等.半巢式熒光定量PCR快速檢測登革Ⅰ型病毒成熟microRNA方法的建立[J].中國病原生物學雜志，2016，11（6）：554-557.

[9]王林.在醫(yī)學檢驗中應用實時熒光定量PCR技術的研究進展[J].當代醫(yī)藥論叢，2015（3）：8-9.

[10]李海紅，侯錫苗.實時熒光定量PCR技術及其在幾類病原體檢測中的應用[J].職業(yè)與健康，2015，31（18）：2586-2589.

[11]趙凱麗，王芳，林牧，等.實時熒光定量PCR技術在手足口病病原體檢測中的臨床應用[J].現代醫(yī)藥衛(wèi)生，2016， 32（15）：2310-2311.

[12]荊成寶，劉婕，趙斌. 實時熒光定量PCR技術檢測患兒手足口病病原體[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2013，34（18）：2458-2459.

[13]錢福文.實時熒光定量PCR在手足口病原體檢測中的應用探討[J].今日健康，2016，15（12）：349.

[14]楊文青，鄒菊賢，閻琳，等. 實時熒光定量PCR檢測肺炎支原體DNA在小兒肺炎診斷中的應用價值[J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志，2014，35（4）：416-418.

[15]寧瑤，李紅勝，陳松勁.實時熒光定量PCR在肺炎支原體DNA檢測中的應用[J].浙江臨床醫(yī)學，2014，16（5）：810-811.

（收稿日期：2016-12-29 本文編輯：馬 越）