外源抗氧化劑硫脲基苯甲酰基硫脲衍生物的合成及促植物生長作用

段志芳，邵 玲，李新昌

（肇慶學院生命科學學院，廣東 肇慶 526061）

外源抗氧化劑硫脲基苯甲酰基硫脲衍生物的合成及促植物生長作用

段志芳，邵 玲，李新昌

（肇慶學院生命科學學院，廣東 肇慶 526061）

以苯甲酸、芳氨基硫脲或單縮二氨基硫脲為原料，合成得到5個取代硫脲基苯甲酰基硫脲衍生物，經紅外、質譜、核磁共振氫譜和元素分析確認了化合物的結構。測定其清除超氧自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）和2，2- 二苯基-1-苦味酰基自由基（DPPH·）的活性及總還原能力，并與維生素C的活性進行比較。以水稻和黃瓜幼苗為試材，用生長測試法、超氧歧化酶（SOD）活性測定法以及過氧化物酶（POD）活性測定法研究這些化合物作為外源抗氧化劑對植物的生長調節作用。結果表明，在測定濃度下，這些化合物均具有清除自由基活性，并對水稻和黃瓜幼苗的生長發育有促進作用，且能激起SOD和POD的活力。

苯甲酰基硫脲；合成；抗氧化；植物生長調節

植物受到逆境脅迫時，會產生過量自由基，從而引發或加劇膜脂過氧化作用，造成細胞膜系統的損傷，嚴重時會導致植物細胞死亡［1-2］。應用外源抗氧化劑能減少自由基對有機體的毒害，提高植物的抗氧化能力，增強其抗逆能力，從而保護細胞［3-4］，如周萬海等［5］發現外源水楊酸（salicylic acid，SA）能調控苜蓿幼苗抗氧化保護系統，緩解鹽脅迫對苜蓿植株的傷害。

硫脲類化合物和苯甲酰基硫脲類化合物具有殺菌、殺蟲、除草和調節植物生長等生物活性［6-8］，在農藥學方面具有潛在的應用價值，如肖彩琴等［9］發現含酰基硫脲查爾酮衍生物對雙子葉油菜籽的生長具有調節作用。目前尚未見對這兩類化合物抗氧化能力的研究。

鑒于不同活性的基團聚集于同一分子中能明顯改善化合物的生物活性，本試驗采用亞結構連接法，將硫脲和苯甲酰基硫脲兩種結構結合在同一分子中，以期實現活性成分的優化疊加，為新農藥篩選提供先導化合物。以苯甲酸為起始原料，通過酰氯化、無溶劑條件下與硫氰酸銨反應得到相應的中間體苯甲酰基異硫氰酸酯，不經分離分別與芳氨基硫脲或單縮二氨基硫脲發生加成反應得到目標化合物，產物經EtOH或DMF/EtOH重結晶，采用紅外、質譜、核磁共振氫譜和元素分析對其進行結構鑒定，通過測定清除超氧自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）和DPPH·及總還原能力研究了它們的抗氧化活性，并以水稻和黃瓜幼苗為試材，測定它們對植物的生長調節作用，初步研究此類化合物抗氧化活性與調節植物生長作用之間的對應關系。合成化合物結構見圖1。

圖 1 合成化合物的結構

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

X-4顯微熔點測定儀（北京，溫度計未校正）；日本島津UV-2550型紫外可見分光光度計；德國Bruker AVANCE AV 400 超導脈沖傅里葉變換核磁共振譜儀；德國Elementar varioEL cube型元素分析儀；美國Nicolet FT-IR 6700型紅外光譜儀（KBr壓片）；美國Thermo公司DSQ質譜儀（EI）；上海HH·B11·420-BS恒溫培養箱。二氯亞砜重蒸后使用，其他試劑均為國產分析純試劑，直接使用。

1.2 目標化合物的合成

苯氨基硫脲、對甲苯氨基硫脲、對氯苯氨基硫脲參照文獻［10］制備；苯乙酮單縮二氨基硫脲、對氯苯甲醛單縮二氨基硫脲參照文獻［11］制備；苯甲酰氯參照文獻［12］制備。

將5 mmol苯甲酰氯、7.5 mmol硫氰酸銨和1滴PEG400置于玻璃研缽中，混和均勻，室溫研磨5 min后，加入4.5 mmol芳氨基硫脲或單縮二氨基硫脲，繼續研磨10 min，固體用蒸餾水洗滌多次，再用無水乙醇洗滌，晾干后用EtOH或DMF/ EtOH重結晶，得化合物1。

N-苯硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1a）：白色固體粉末，產率28.71%，m.p.252～254℃；1H NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：13.73（s，1H，PhNH），11.77（s，1H，CONHCS），10.76（s，1H，CSNH），10.38（s，1H，NHCS），6.95～8.11（m，10H，Ar-H）；IR（KBr）ν：3341、3211、3111（NH），3027，3004，1678（C=O），1604，1510，1447，1322，1223、1170（C=S），1087，746，695；EI-MS m/z （%）：330（M+，1.01），296（2.81），135（44.02），105（100），77（67.04），65（3.99），51（10.06）；Anal. calcd. for C15H14N4OS2：C 54.54，H 4.24，N 16.97；found C 54.31，H 4.19，N 16.85。

N-對甲苯硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1b）：白色固體粉末，產率33.64%，m.p.247～249℃；1H NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：13.71（s，1H，PhNH），11.75（s，1H，CONHCS），10.64（s，1H，CSNH），10.29（s，1H，NHCS），7.17～7.99（m，9H，Ar-H），2.29（s，3H，-CH3）；IR（KBr）ν：3209、3152（NH），3014，1671（C=O），1579，1528，1452，1212、1163（C=S），1092，842，717，695，670；EI-MS m/z （%）：344（M+，0.07），175（11.69），149（39.01），102（17.11），105（100），77（57.49），51（10.85）；Anal. calcd. for C16H16N4OS2：C 55.81，H 4.65，N 16.28；found C 55.67 ，H 4.49，N 16.15。

N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1c）：淡黃色固體粉末，產率36.10%，m.p.278～280℃；1H NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：13.73（s，1H，PhNH），11.78（s，1H，CONHCS），10.86（s，1H，CSNH），10.46（s，1H，NHCS），7.39～7.99（m，9H，Ar-H）；IR（KBr）ν：3334、3199、3157、3093（NH），3066，3007，1669（C=O），1603，1526，1450，1210、1161（C=S），1089，838，716，694，667；EI-MS m/z （%）：364（M+，0.02），330（3.84），237（2.82），195（9.67），177（3.39），169（34.05），122（14.71），111（17.82），105（100），77（57.49），65（3.94），51（10.85）；Anal. calcd. for C15H13ClN4OS2：C 49.38，H 3.57，N 15.36；found C 49.88，H 3.55，N 15.54。

N-對氯苯甲醛縮氨基硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1d）：白色固體粉末，產率68.55%，m.p.210～212℃；1H NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：13.50（s，1H，NHC=S），12.35（s，1H，C=SNHC=O），11.95（s，1H， =NNH），11.07（s，1H，C=SNH），8.16（s，1H，CH=N），7.53～8.01（m，9H，Ar-H）；IR（KBr） ν：3251、3158（NH），3004，1679（C=O），1594、1518、1459（Ar），1234、1166（C=S），1087，830，711，670；EI-MS m/z （%）：391（M+，0.09），228（3.14），196（7.77），138（10.70），122（6.00），111（19.10），105（100），89（5.99），77（50.94），51（10.24）；Anal. calcd. for C16H14ClN5OS2：C 49.03，H 3.58，N 17.88；found C 49.29，H 3.43，N 17.96。

N-苯乙酮縮氨基硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1e）：白色固體粉末，產率76.61%，m.p.198～200℃；1H NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：13.90（d，J=8.0Hz，1H，NHC=S），11.99（s，1H，C=SNHC=O），11.40（s，1H，=NNH），11.26（d，J=7.8Hz，1H，C=SNH），7.45～8.02（m，10H，Ar-H），2.41（s，3H，CH3）；IR（KBr） ν：3433、3210、3084、3054（NH），3022，1668（C=O），1600、1520、1459（Ar），1234、1167（C=S），1087，850，713，691；EI-MS m/z （%）：371（M+，0.06），118（12.76），105（100），77（60.97），51（11.43）；Anal. calcd. for C17H17N5OS2：C 54.99，H 4.58，N 18.87；found C 55.08，H 4.32，N 18.73。

1.3 抗氧化活性試驗

新化合物抗氧化活性試驗參照文獻［13-14］進行，試樣濃度配制為1.0 mg/mL二甲亞砜溶液，其中羥自由基由Fe2+-H2O2-水楊酸體系產生，超氧自由基采用堿性條件下鄰苯三酚的自氧化產生，DPPH·自由基用無水乙醇配制使用，還原能力測定采用鐵氰化鉀還原法，并與常用抗氧化劑維生素C進行比較。

1.4 促植物生長試驗

取新化合物分別用少量二甲亞砜溶解，加入一滴乳化劑，用蒸餾水稀釋至10 ppm，空白對照用蒸餾水。對水稻和黃瓜幼苗的生長活性測試分別用生長測試法［15］、SOD活性測定法［16-17］以及POD活性測定法［18-19］，并與植物生長調節劑吲哚乙酸（IAA）進行比較。

2 結果與分析

2.1 目標化合物的合成

將苯甲酰氯和硫氰酸銨在無溶劑條件下與催化劑PEG-400室溫研磨，然后加入芳氨基硫脲或單縮二氨基硫脲反應得到相應產物，反應過程中不使用有機溶劑，避免資源浪費和環境污染，具有操作簡單、反應條件溫和、環境友好等特點，為目標化合物的合成提供了一條綠色途徑。

2.2 目標化合物的譜圖分析

2.2.1 目標化合物的紅外譜圖分析 以化合物1c的紅外光譜為例，在3 066～3 334 cm-1處出現中等強度的吸收峰或強的寬峰，為 N-H伸縮振動特征吸收峰。在1 669 cm-1處出現的強吸收峰為C=O 的伸縮振動特征吸收峰。在3007 cm-1左右出現的吸收峰為苯環的 C-H 伸縮振動吸收峰，1 603、1 489、1 450 cm-1左右出現的峰為苯環骨架振動吸收峰。在 1581、1526 cm-1處出現的強、寬吸收峰為C-N 的伸縮振動和-NH-彎曲振動吸收峰，在1210、1161 cm-1處出現的中等強度吸收峰為 C＝S 的伸縮振動吸收峰，1265 cm-1處出現的強吸收峰為C-N-C 反對稱伸縮振動吸收峰，1090 cm-1處出現的中等強度吸收峰為C-N-C對稱伸縮振動吸收峰.

2.2.2 目標化合物的氫核磁共振譜圖分析 以化合物1c的核磁氫譜為例，可以看到4個N-H的共振吸收峰（單峰），與其化學環境相符合。O=CNHC=S中N-H中的氫原子處在-C=S-的正屏蔽區，化學位移比NHC=S位于高場。由于-NHCS-中的H原子易與分子中的羰基（C=O）上的氧原子形成六元環的分子內氫鍵，產生較強的去屏蔽效應，使H原子電子云密度降低，其抗磁性屏蔽效應減小，從而導致核磁共振信號移向低場。

2.2.3 目標化合物的質譜圖分析 以化合物1c的質譜圖為例，該化合物的分子離子峰很弱，其他離子峰可以得到較好的解釋，其中質荷比為330的離子峰形成的可能途徑見圖2。

圖2 質荷比為330的離子峰形成的可能途徑

表1 化合物 1a～1e和維生素C在1.0 mg/mL濃度下抗氧化活性

2.3 目標化合物體外抗氧化活性

測定了新化合物清除超氧自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）和2，2-二苯基-1-苦味酰基自由基（DPPH·）的活性及總還原能力，并同維生素C（Vc）抗氧化活性進行了比較。試驗過程中選用了多個濃度，結果發現低濃度時，清除自由基效果較弱，高濃度時化合物在測定體系中的溶解度小，清除自由基效果也較弱，為便于比較，選用濃度為1.0 mg/mL時的試驗結果。從表1可以看出，這些化合物均具有清除自由基活性，其中N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1c）和N-對氯苯甲醛縮氨基硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1d）清除超氧自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）及總還原能力均較強，可以作為抗氧化劑使用，但其抗氧化活性弱于Vc。

2.4 目標化合物促植物生長活性

為測定新化合物對植物的生物活性作用，分別以水稻和黃瓜幼苗為試驗材料，用la～le 5個化合物所配制的溶液進行一個星期培養，然后用生長測試法、超氧歧化酶（SOD）活性測定法以及過氧化物酶（POD）活性測定法測定相應指標，結果如圖3～6所示。

圖3、圖4生長測試法結果表明，用5種目標化合物溶液培養的水稻和黃瓜幼苗的重量、株高以及根長明顯比蒸餾水培養的有所增加。由此可知，這5種新型的硫脲基苯甲酰基硫脲化合物對水稻和黃瓜幼苗的生長均有促進作用，其中化合物N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1c）和化合物N-對氯苯甲醛縮氨基硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1d）對水稻幼苗的作用較為明顯，化合物N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1c）和化合物N-苯乙酮縮氨基硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1e）對黃瓜幼苗的作用是較為明顯的。

根據圖5、圖6結果，用5種目標化合物溶液培養的水稻和黃瓜幼苗SOD、POD總活性均明顯提高。其中化合物N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1c）和化合物N-對氯苯甲醛縮氨基硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1d）對水稻幼苗SOD、POD的增強作用較為明顯，化合物N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1c）和化合物N-苯乙酮縮氨基硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1e）對黃瓜幼苗SOD、POD的增強作用較為明顯，且超過IAA（吲哚乙酸）的效果。

圖3 目標化合物對水稻幼苗根長、株高和重量的作用

圖5 目標化合物對水稻和黃瓜幼苗SOD活性的影響

圖6 目標化合物對水稻和黃瓜幼苗POD活性的影響

由以上試驗結果可以看出，5個新化合物對水稻和黃瓜幼苗的生長發育均有促進作用，且能增強幼苗體內SOD和POD的活力，其中化合物N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1c）對水稻和黃瓜幼苗促生長活性作用均較為明顯。

3 結論與討論

植物生長調節劑是用于調節植物生長發育的一類農藥，使用合成的化學調節劑來控制植物生長已成為一種新的農業技術，被廣泛應用于大田作物、經濟作物、果樹、林木、蔬菜、花卉等各個方面，其研究及在生產上的應用是近代植物生理學及農業科學的重大進展之一。此類物質在研發過程中，因涉及到植物的生長過程，所需周期較長，存在不足之處。本論文首次研究苯甲酰基硫脲類外源抗氧化劑對植物生理特性的影響，在無溶劑條件下由苯甲酰基異硫氰酸酯與芳氨基硫脲或單縮二氨基硫脲發生加成反應得到5個相應的硫脲基苯甲酰基硫脲衍生物，具有操作簡單、反應條件溫和和環境友好等特點，為此類型化合物提供了一條綠色合成途徑。經紅外、質譜、核磁共振氫譜和元素分析確認了新化合物的結構。體外測定了這些新化合物清除超氧自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）和DPPH·自由基的活性及還原能力。并采用生長測試法、SOD活性測定法以及POD活性測定法比較它們對水稻和黃瓜幼苗的促生長作用。結果表明，在測定濃度下，這些化合物均具有體外清除自由基活性，其中N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1c）和N-對氯苯甲醛縮氨基硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1d）清除超氧自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）及總還原能力均較強。這些化合物對水稻和黃瓜幼苗的生長均有促進作用，并能提高SOD和POD的活性，其中化合物N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲對二者作用均較為明顯（1c）。結果表明，該類化合物體外抗氧化能力與促植物生長作用之間可能有一定相關性。該研究結果既提供了一種綠色合成方法，為設計與合成活性更高的酰基硫脲化合物分子提供理論依據，又可以通過體外抗氧化試驗結果篩選出有效化合物，用于植物生長調節劑的開發，可以減輕試驗量，縮短農藥開發周期。

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（責任編輯 白雪娜）

Synthesis of thiourea benzoylthiourea derivatives as exogenous antioxidants and their plant growth- promoting effects

DUAN Zhi-fang，SHAO Ling，LI Xin-chang
（College of Life Science，Zhaoqing University，Zhaoqing 526061，China）

Five thiourea benzoylthiourea derivatives were synthesized by using benzoic acid，arylthiosemicarbazide or thiosemicarbazones as raw materials. Their structures were characterized by UV，IR，1H-NMR and MS. Their scavenging effects on the superoxide radical（O2-·），hydroxyl radical（·OH） and DPPH· radical and their total reduction capacity were compared with ascorbic acid（Vc） as the reference material. As exogenous antioxidants，their promoting effects on plant growth of rice and cucumber were tested by the methods of growth test，superoxide dismutase（SOD） and peroxidase（POD） activity determination. The results showed that at the determinated concentration，these compounds all had scavenging effects on these radicals，and also could promote the growth of rice and cucumber，at the same time increase their SOD and POD activity.

benzoylthiourea； synthesis； antioxidant activity； plant growth regulator

S482.8

A

1004-874X（2017）03-0113-07

2016-12-29

廣東省科技計劃項目（2014A030304070）

段志芳（1973-），女，博士，副教授，E-mail：zhaoqing606@126.com

段志芳，邵玲，李新昌.外源抗氧化劑硫脲基苯甲酰基硫脲衍生物的合成及促植物生長作用［J］.廣東農業科學，2017，44（3）：113-119.