Spz1和Rap1b在食管鱗癌中的表達及臨床意義

張靈敏,宋麗萍,王 強,張明鑫(西安交通大學第一附屬醫院麻醉科,西安 7006;西安交通大學第一附屬醫院放療科;第四軍醫大學唐都醫院消化內科;通訊作者,E-mail:zmx5@6.com)

Spz1和Rap1b在食管鱗癌中的表達及臨床意義

張靈敏1,宋麗萍2,王 強1,張明鑫3*
(1西安交通大學第一附屬醫院麻醉科,西安 710061;2西安交通大學第一附屬醫院放療科;3第四軍醫大學唐都醫院消化內科;*通訊作者,E-mail:zmx3115@163.com)

目的 探討生精亮氨酸拉鏈蛋白1(spermatogenic leucine zipper 1,Spz1)和Ras相關蛋白1b(Ras-related protein 1b,Rap1b)在人食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)組織中的表達變化,分析兩者的相關性及其與病理特征的關系。 方法 收集病理資料詳實的60例食管鱗癌組織和30例癌旁組織,采用免疫組化SP法檢測Spz1和Rap1b的表達,分析其與臨床病理特征的關系以及兩者表達的相關性。 結果 Spz1和Rap1b在ESCC組織中的表達的強陽性率分別為83.3%，80.0%,明顯高于癌旁組織(33.3%，40%,P<0.05);且在分化程度較低以及有淋巴轉移患者中,Spz1和Rap1b均呈現顯著高表達(P<0.05);而在不同年齡、不同性別、是否吸煙、是否飲酒、不同病變長度以及不同病變位置之間差異無統計學意義(P>0.05);Spz1和Rap1b表達之間具有正相關(P<0.05,r=0.559)。 結論 Spz1和Rap1b在ESCC中均高表達,并與分化程度和淋巴轉移密切有關,提示可能在ESCC發展及轉移中發揮重要作用。

Spz1； Rap1b； 食管鱗癌

食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)在包括我國在內的東亞地區發病率遠遠高于其他國家,雖然近年來手術技術及靶向藥物不斷進展和發現,但ESCC的預后仍不佳,5年生存率仍不足20%[1]。因此,有必要進一步探討ESCC的發生發展的分子機制,尋找新的治療靶點及信號通路。Ras信號通路在包括ESCC在內的多種腫瘤中發揮重要作用,新近發現生精亮氨酸拉鏈蛋白1(spermatogenic leucine zipper 1,Spz1)作為Ras信號通路Raf/MAPK的下游,參與腫瘤細胞的增殖及形成[2]。而Ras相關蛋白1b(RAS-related protein 1b,Rap1b)作為另外一個Ras信號通路蛋白,在課題組之前的研究中被證實與ESCC密切相關[3]。但Spz1和Rap1b在ESCC中的表達及意義罕見報道。本研究通過免疫組化SP法檢測Spz1和Rap1b的表達,并分析兩者表達的臨床病理意義以及兩者的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

ESCC標本取自第四軍醫大學唐都醫院2014-2015年間手術切除的患者標本,共60例,所有病例經HE染色均證實為ESCC,所有病例術前均沒有化療、放療以及免疫治療史。同時在距癌組織邊緣>5 cm 處的食管正常組織取標本作為癌旁對照,最終經HE 染色確認為無癌組織浸潤,無明顯炎癥細胞浸潤的癌旁組織共計30例。標本用體積分數10%多聚甲醛固定,常規石蠟包埋,制備4 μm切片,進行免疫組化檢測和病理組織學觀察。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 Spz1兔抗人多克隆抗體為美國GeneTex公司產品(GTX87570),Rap1b兔抗人多克隆抗體為上海生工生物科技公司產品(D220264),稀釋后作為一抗(滴度分別為1 ∶200和1 ∶500),通用型SP系列工作液試劑盒(SP-9000)及DAB顯色試劑盒(ZLI-9032)購自中山金橋生物公司。采用免疫組化SP法,染色步驟嚴格按照說明書進行。以已知陽性反應片作為陽性對照,以無關血清代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 結果判定 由兩位高年資病理科醫生獨立評定,當出現分歧時共同評定。蛋白表達均以細胞質或細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性,并參照文獻[3]的方法并略做改進:每張切片隨機觀察5個高倍視野,每個視野計數1 000個細胞,用各視野中陽性細胞數的平均百分數作為該切片的陽性細胞百分比進行計分:0-24%為1分,25%-49%為2分,50%-74%為3分,>75%為4分。染色強度以多數陽性細胞呈現的染色特征為標準計分:細胞未著色為或呈淡黃色為0分,棕黃色為1分,棕褐色為2分。為進行統計分析,兩者相乘,以超過4為強陽性表達(高表達),余為弱陽性表達(低表達)。

1.3 統計學分析

運用SPSS 13.0統計軟件對結果進行處理,計量資料采用卡方檢驗。所有的檢驗均為雙側,P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Spz1和Rap1b在ESCC組織的表達

根據已知陽性對照片,陽性細胞呈片狀分布的棕褐色顆粒,而陰性對照未見棕黃色顆粒。Spz1主要定位于細胞核和細胞漿,并以細胞核為主,Rap1b也主要定位在細胞核和細胞漿,但以細胞漿為主(見圖1),而在癌旁組織中Spz1和Rap1b均定位在細胞漿。Spz1在ESCC中的陽性率為83.3%,而在癌旁組織中的陽性率為33.3%,兩者相比差異有統計學意義;Rap1b在ESCC中的陽性率為80%,而在癌旁組織中的陽性率為40%,兩者相比差異亦有統計學意義(P<0.05)。

表1 Spz1和Rap1b在ESCC中的表達

Table 1 Expression of Spz1 and Rap1b in ESCC

組織 nSpz1低表達高表達χ2PRap1b低表達高表達χ2P 食管鱗癌60105022 50 000124814 40 000 癌旁組織3020101812

A．Spz1在ESCC中的表達B．Rap1b在ESCC中的表達C．Spz1在癌旁組織中的表達D．Rap1b在癌旁組織中的表達圖1 Spz1與Rap1b在ESCC中的表達(×200)Figure1 ExpressionofSpz1andRap1binESCCandnon?tumoradjacenttissues(NAT)(×200)

2.2 Spz1和Rap1b在ESCC中的表達及其與臨床病理特征的關系

根據免疫組化結果,對60例ESCC患者Spz1和Rap1b的表達情況進行卡方檢驗顯示,Spz1和Rap1b的表達與病理分化程度及淋巴轉移有關(P<0.05),即在分化程度較低和有淋巴轉移的患者中,Spz1與Rap1b均呈現高表達。而與患者的年齡、性別、是否吸煙、是否飲酒、病變長度以及病變位置均無關(P>0.05,見表2)。

2.3 Spz1和Rap1b在ESCC中的表達的相關性

采用卡方檢驗對ESCC組織中Spz1與Rap1b表達水平的關系進行分析,結果顯示在50例Spz1強表達的標本中,有45例Rap1b強表達,在10例Spz1弱表達的標本中,有7例Rap1b弱表達;二者在統計學上具有正相關性(r=0.559,P=0.000)。

表2 Spz1與Rap1b的表達與臨床病理指標的相關性

Table 2 Relationships between the expression of Spz1 and Rap1b and clinicopathologic features

臨床特征nSpz1低表達高表達χ2PRap1b低表達高表達χ2P年齡0 1320 7170 6590 417 <60歲39633930 ≥60歲21417318性別2 3180 1280 4290 513 男35827827 女25223421吸煙1 8640 1720 0190 890 是41536833 否19514415飲酒0 7550 3851 5600 212 是19217217 否418331031淋巴轉移9 1760 0027 4830 006 否3410241123 是26026125腫瘤分化程度8 8130 0035 0940 024 低37235433 高+中23815815長度0 2140 6430 0670 796 >5cm28424622 ≤5cm32626626腫瘤位置0 0570 8111 1480 284 下段+中段38632632 上段22418616

表3 Spz1與Rap1b的在ESCC中表達的相關性

Table 3 Correction between Spz1 and Rap1b expression in ESCC

Spz1Rap1b低表達高表達χ2Pr低表達7318 750 0000 559高表達545

3 討論

自從1982年發現了編碼Ras蛋白的基因突變可以導致腫瘤后,幾十年的不斷研究明確了Ras家族的關鍵基因及信號通路:多種小GTP酶和3種Ras基因亞型(包括KRAS、NRAS、HRAS)共同組成了Ras家族[4]。Ras發揮一個開關作用,處于活化(GTP)或非活化狀態(GDP),在活化狀態下,激活多條信號通路,最為常見的是下述3條信號通路:Raf-MAPK途徑;PI3K信號途徑;Ral-GEFs途徑[5]。包括ESCC在內的多種腫瘤中,Ras家族及其上下游信號通路發揮重要的致癌作用,并為治療提供了靶點[5,6]。故本課題組持續關注Ras信號通路在ESCC中的作用及相關機制。

Rap1b是Rap1的亞型之一,屬于Ral-GEFs途徑,其缺失可以導致血管生成、內皮細胞遷移及增殖的功能受損以及MAPK信號通路的受阻[7-9]。Rap1b在腫瘤組織中表達上調,通過促進增殖和轉移在結腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中發揮癌基因功能[10-12]。課題組前期研究發現:Rap1b作為Ras蛋白的一種,可被抑癌基因miR-518b轉錄后調控[3]。Spz1屬于堿性螺旋-圈環-螺旋轉錄因子(bHLH)家族成員之一,在小鼠精子文庫研究中被發現,并認為與精子生成關系密切[11]。進一步的研究發現,轉基因鼠和裸鼠模型中Spz1作為Ras/Raf/MAPK的下游途徑,通過結合PCNA(proliferating cell nuclear antigen)的啟動子區域,上調其表達進而調控細胞增殖、正常細胞的惡性轉化以及腫瘤形成[2]。故Spz1可以認為Ras信號通路相關的轉錄因子。但是Spz1和Rap1b在ESCC中的表達及臨床意義未見報道。

基于上述研究背景和研究基礎,課題組探討了兩者在ESCC中的表達變化、臨床意義以及兩者的相關性,結果提示:ESCC中Spz1和Rap1b表達均顯著高于癌旁組織,而兩者的高表達與病理分化程度及淋巴轉移有關,說明Spz1和Rap1b在ESCC中發揮癌基因功能。相關性分析表明,兩者在ESCC組織中的表達具有相關性(P<0.05,r=0.559)。Spz1作為轉錄因子,極有可能對Rap1b的表達起調控作用。

綜上所述,Spz1/Rap1b信號通路應該在ESCC發生發展中發揮重要作用,但具體機制及相關功能仍有待進一步探討。

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Expression and clinical significance of Spz1 and Rap1b in esophageal squamous cell carcinoma

ZHANG Lingmin1,SONG Liping2,WANG Qiang1,ZHANG Mingxin3*
(1DepartmentofAnesthesiology,FirstAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2DepartmentofRadiotherapy,FirstAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity;3DepartmentofGastroenterology,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:zmx3115@163.com)

ObjectiveTo explore the expression of Spz1 and Rap1b in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)and its clinical significance.MethodsExpression of Spz1 and Rap1b in 60 cases of ESCC and 30 cases of non-tumor adjacent tissues (NAT) were detected by immunohistochemistry(SP assay).The correlation between expression of Spz1 and Rap1b and their relationships with clinical features were analyzed.ResultsPositive expression rate of Spz1 and Rap1b was 83.3% and 80.0%,which was significantly higher than that in NAT respectively (33.3%,40.0%,P<0.05).Over-expression of Spz1 and Rap1b was correlated with tumor differentiation and lymph node metastasis(P<0.05),but not with sex,age,drink,smoke,length,and tumor location.The expression of Spz1 was positively correlated with the expression of Rap1b(r=0.559,P<0.05).ConclusionSpz1 and Rap1b expression is high in ESCC,implicating that the Spz1/Rap1b signal pathway might play an important role in the development of ESCC.

Spz1； Rap1b； esophageal squamous cell carcinoma

國家自然科學基金資助項目(81302055)

張靈敏,女,1984-07生,碩士,主治醫師,E-mail:zlm711@163.com

2017-01-23

R735.1

A

1007-6611(2017)05-0471-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.015