生物免疫傳感器檢測遲緩愛德華氏菌研究*

王淑嫻， 曲梁靜， 刁 菁， 王曉璐， 葉海斌， 魏鑒騰

(1.山東省海洋生物研究院 病害與漁藥研究中心，山東 青島 266104；2.中國科學(xué)院 蘭州化學(xué)物理研究所 中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.青島市資源化學(xué)與新材料研究中心，山東 青島 266000)

生物免疫傳感器檢測遲緩愛德華氏菌研究*

王淑嫻1， 曲梁靜1， 刁 菁1， 王曉璐1， 葉海斌1， 魏鑒騰2,3

(1.山東省海洋生物研究院 病害與漁藥研究中心，山東 青島 266104；2.中國科學(xué)院 蘭州化學(xué)物理研究所 中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.青島市資源化學(xué)與新材料研究中心，山東 青島 266000)

遲緩愛德華氏菌(E.tarda)是最為嚴(yán)重的水產(chǎn)動物致病菌之一，準(zhǔn)確、即時的檢測手段是預(yù)防控制該菌傳播的關(guān)鍵所在。通過量子點(QDs)標(biāo)記E.tarda單克隆抗體(Ab)，利用生物免疫傳感器技術(shù)實現(xiàn)E.tarda的快速、特異性檢測。結(jié)果顯示，QDs-Ab的熒光通過加入氧化石墨烯(GO)產(chǎn)生淬滅，構(gòu)建了捕獲目標(biāo)細菌的探針，GO最適淬滅濃度為60 μg/L。細菌捕獲探針中加入E.tarda后，能夠檢測到重新恢復(fù)強度的橙色熒光。針對E.tarda設(shè)計的生物免疫傳感器的特異性，選取燦爛弧菌、溶藻膠弧菌、副溶血弧菌和嗜水氣單胞菌作為對照，結(jié)果顯示，對照組不能明顯引起熒光強度的改變，而實驗組卻能顯著提高熒光強度。本研究建立的基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)的具有高靈敏度和特異性的生物傳感器檢測方法在細菌的早期診斷中有良好的應(yīng)用潛質(zhì)。

生物免疫傳感器； 遲緩愛德華氏菌； 氧化石墨烯； 量子點； 熒光能量共振轉(zhuǎn)移

0 引 言

遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)是一種革蘭氏陰性菌，兼性厭氧菌，體短，桿狀，可運動，屬于Enterobacteriaceae家族，長度為2～3 μm，直徑為 1 μm[1]。該菌宿主廣泛，包括魚類、鳥類、爬行類以及人類[2,3]。E.tarda感染人后能夠引起腸胃疾病以及其他癥狀，比如肌壞死和傷口感染等。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，E.tarda被認(rèn)為是最為嚴(yán)重的致病菌之一，因為它能廣泛地感染海水以及淡水魚，包括牙鲆、羅非魚、鰻魚以及斑點叉尾魚[4,5]。E.tarda感染魚類后，導(dǎo)致宿主產(chǎn)生一種被稱為E.tarda的系統(tǒng)性疾病，該病在牙鲆中的癥狀表現(xiàn)為出血、敗血病、皮膚損傷以及肝腸腎的壞死等[6,7]。為有效控制E.tarda病原的擴散, 準(zhǔn)確、即時的檢測手段是預(yù)防控制該菌傳播的關(guān)鍵。

目前，由于生物傳感器技術(shù)的快速、簡單、高靈敏度以及良好的重現(xiàn)性，使得這種方法越來越受到人們的關(guān)注[8～13]。人們將納米技術(shù)應(yīng)用到生物傳感器的研究中提高生物檢測的靈敏度和特異性[14,15]。多種納米材料，包括半導(dǎo)體量子點(QDs)、金屬或半導(dǎo)體納米線、碳納米管(CNTs)、納米結(jié)構(gòu)的導(dǎo)電聚合物在光學(xué)和電傳感器的應(yīng)用中已經(jīng)有了廣泛報道[16～19]。作為迄今為止最薄、最硬材料的石墨烯迅速成為相關(guān)領(lǐng)域研究的明星[20～24]。氧化石墨烯(GO)是石墨烯的一種重要的衍生物，主要通過化學(xué)方法剝離石墨得到。相對石墨烯，GO不但具有平面結(jié)構(gòu)，且含有較多的含氧功能基團(環(huán)氧基、羥基、羧基)。這使得GO能夠容易分散到各種溶劑中,極大擴展了GO在材料、化學(xué)及傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。GO自身具有熒光性質(zhì)，可以制備熒光分析探針，構(gòu)建熒光傳感器。同時GO通過熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)和非輻射偶極—偶極相互作用能有效淬滅熒光體(染料分子,QDs及上轉(zhuǎn)換納米材料)的熒光。在基于FRET的系統(tǒng)中，QDs由于其固有的光學(xué)性質(zhì)，例如：高量子產(chǎn)率，高漂白閾值，良好的化學(xué)穩(wěn)定性，窄發(fā)射峰等已經(jīng)被廣泛地用作有效能量轉(zhuǎn)移供體[8,25,26]。

本文建立了一種新的檢測方法，通過QDs標(biāo)記E.tarda單克隆抗體(Ab)，實現(xiàn)E.tarda的快速、特異性檢測。

1 檢測方法

檢測方案見圖1。首先將抗體與生物素連接，再將鏈霉素共價修飾的發(fā)橙色熒光的QDs通過鏈霉素—生物素相互反應(yīng)與抗體連接起來得到量子點—抗體(QDs-Ab)。QDs-Ab的熒光通過加入GO產(chǎn)生了淬滅，從而構(gòu)建了捕獲目標(biāo)細菌的探針。一旦這種細菌捕獲探針暴露于E.tarda中，由于抗原抗體共價反應(yīng)，QDs-Ab將被釋放出來，從而能夠檢測到重新恢復(fù)強度的橙色熒光。利用這一新型檢測方法，能夠快速、特異地檢測E.tarda。

圖1 GO生物免疫傳感器用于E.tarda快速檢測方法示意

2 材料與過程

2.1 材 料

NaH2PO4·2H2O，Na2HPO4·12H2O,NaCl，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；生物素N—羥基琥珀酰亞胺酯，N,N—二甲基甲酰胺購自Sigma公司；E.tarda由本實驗室保種；Ab購自Santa Cruz生物技術(shù)有限公司；GO購自蘇州恒球石墨烯科技有限公司；QDs標(biāo)記的鏈霉親和素—605(SA-QDs)購自武漢珈源量子點公司。

2.2 儀 器

紫外可見吸收光譜數(shù)據(jù)由UV—2550紫外—可見光分光光度計測定；熒光光譜數(shù)據(jù)由F96PRO熒光分光光度計收集。

2.3 過 程

2.3.1 制備菌懸液

將E.tarda傳代培養(yǎng)3次，28 ℃過夜培養(yǎng)，吸取1 mL菌液，滅菌生理鹽水梯度稀釋后用血球計數(shù)板計數(shù)。

2.3.2 生物素—抗體制備

Ab的濃度為0.1 g/L。用N,N—二甲基甲酰胺將生物素N—羥基琥珀酰亞胺酯配制成2.5 g/L的溶液，將0.8 μL溶液迅速加入10 μL Ab溶液中，冰浴2.5 h。過量未反應(yīng)和水解的生物素用微量透析管4 ℃攪拌透析8 h去除，換液1～2次。生物素—抗體的終濃度用紫外—可見光分光光度計測定為0.2 g/L。

2.3.3 QDs-Ab制備

將1 μmol/L的量子點標(biāo)記的鏈霉親和素—605與合適濃度的生物素—抗體在10 mmol/L PBS溶液中混合，避光輕柔震蕩15 min。加入過量的生物素封閉QDs-Ab，再用微量透析管4 ℃攪拌避光透析8 h，換液1～2次。

2.3.4 熒光檢測

該反應(yīng)體系包括適當(dāng)濃度的QDs-Ab,GO和E.tarda，由15 mmol/L的PBS(pH 8.0,15 mmol/L NaCl)緩沖液配制，終體積為0.6 mL。溶液的熒光發(fā)射光譜，在15 min后測定。所有的光學(xué)測量在室溫環(huán)境條件下進行，激發(fā)波長(λex)為350 nm。

3 結(jié)果與討論

在最近的研究中，GO由于其獨特的電子、機械和熱能性在生物檢測領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[28]。而QDs一直因為各種杰出的光學(xué)特性，包括高量子產(chǎn)率、廣激發(fā)光譜、窄發(fā)射光譜和耐光漂白性[29]成為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)能量供體的熱門選擇。該免疫傳感器是基于FRET技術(shù)建立起來的，其中QDs和GO分別是能量供體和受體。

本文利用GO能夠淬滅QDs熒光的性質(zhì)研究了FRET技術(shù)的性能。當(dāng)發(fā)橙色熒光的QDs-Ab靠近GO時，GO的超強淬滅能力即發(fā)揮作用。圖2為當(dāng)加入不同濃度的GO時，F(xiàn)RET免疫傳感器的熒光光譜，其中，GO的濃度為0,1,3,5,10,15,30,45,60,75 μg/L(從上到下)。當(dāng)GO的濃度從5 μg/L增加至75 μg/L時，熒光強度顯著下降。當(dāng)GO的濃度小于1 μg/L時，熒光淬滅的效果不甚明顯，這可能是由于GO與QDs-Ab之間沒有完全吸收造成的。ΔF值隨著GO濃度的增加而升高，當(dāng)GO濃度超過75 μg/L時，ΔF值進入平臺期，這表明QDs-Ab被完全吸附在GO上,如圖3所示。當(dāng)細菌捕獲探針體系中加入E.tarda后，過量的GO將不利于QDs-Ab的解吸附。本研究中GO的最適濃度為60 μg/L。

圖2 加入不同濃度的GO后QDs-Ab (1 nmol/L)的熒光光譜

圖3 在605 nm處QDs-Ab隨GO濃度變化的熒光淬滅曲線

QDs-Ab與GO之間通過π-π非共價鍵的相互作用使得QDs-Ab能夠靠近GO表面。QDs-Ab的高效熒光淬滅現(xiàn)象可以被視為QDs-Ab與GO之間有效的FRET直接結(jié)果。QDs-Ab與GO之間極強的相互作用以及GO的高度穩(wěn)定性和水溶性使得GO成為一種極好的淬滅劑[12]。超高的淬滅效率能夠?qū)е乱粋€很高的信噪比，可實現(xiàn)目標(biāo)檢測的高靈敏性。利用QDs-Ab與GO之間的FRET原理，初步構(gòu)建了一個高度靈敏的細菌檢測方法。在最適條件下，利用“打開”式熒光檢測模型可以檢測E.tarda。圖4為加入不同濃度細菌后，Ab-QDs-GO熒光強度變化情況。其中，E.tarda的濃度為0,2×102,2×103,2×105,2×107CFU/mL(從下到上)

圖4 加入不同濃度E.tarda后Ab-QDs-GO的熒光圖譜

在評價一種新型免疫傳感器的潛在應(yīng)用性能時，特異性指標(biāo)是一個非常重要的因素。因此,為了檢測針對E.tarda設(shè)計的FRET傳感器的特異性，本研究選取了燦爛弧菌、溶藻膠弧菌、副溶血弧菌和嗜水氣單胞菌作為對照,如圖5所示。圖中曲線從上到下，依次為Ab-QDs-GO-E.tarda；Ab-QDs-GO-燦爛弧菌；Ab-QDs-GO-溶藻膠弧菌；Ab-QDs-GO-副溶血弧菌；Ab-QDs-GO-嗜水氣單胞菌；Ab-QDs-GO。結(jié)果顯示，對照組不能明顯引起熒光強度的改變，而實驗組卻能顯著提高熒光強度。檢測結(jié)果說明，該FRET免疫傳感器可以特異性地檢測E.tarda。

圖5 加入不同種細菌后Ab-QDs-GO的熒光圖譜

3 結(jié) 論

由于水溶性的GO對QDs具有超強的淬滅作用，本研究建立了一種基于FRET的具有高靈敏度和特異性的生物傳感器檢測方法，該方法能夠快速、靈敏、特異性地檢測E.tarda。基于GO的生物傳感器構(gòu)建簡單并且有一些顯著的優(yōu)點：1)GO對QDs的超強淬滅效率導(dǎo)致背景很低，使本文方法具有很好的靈敏性和選擇性。2)由于GO可以作為不同種QDs的能量受體，因此,該檢測方法不像其他常規(guī)能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，不需要特殊配對的能量供體和受體。通過改變抗體，該檢測方法可以實現(xiàn)任意細菌的檢測，在細菌的早期診斷中有良好的應(yīng)用潛質(zhì)。

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Research of immuno-biosensor for Edwardsiella tarda detection*

WANG Shu-xian1, QU Liang-jing1, DIAO Jing1, WANG Xiao-lu1, YE Hai-bin1, WEI Jian-teng2,3

(1.Mariculture Institute of Shandong Province,Shandong Province Key Laboratory for Disease Control of Mariculture,Qingdao 266104,China; 2.Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources and Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province,Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China; 3.Center of Resource Chemical & New Material,Qingdao 266000,China)

Edwardsiella tarda has been recognized as one of the most serious aquatic animal pathogens.Real-time and accurate means of detection is the key for prevention and control of spread of Edwardsiella tarda.In this present work,a novel detection strategy is designed to realize rapid and specific determination of Edwardsiella tarda by labeling Edwardsiella tarda monoclonal antibody(Ab)with QDs.The results show that the fluorescence of these QDs-Ab bioconjugates is quenched by GO to produce a bacterium capture probe. And the optimal quenched concentration of Graphene oxide is 60 μg/L.When the bacterium capture probe is exposed to the targets of Edwardsiella tarda, orange color fluorescence is turned on by releasing the QDs-Ab due to the antibody antigen combination.The specificity of the FRET sensor towards Edwardsiella tarda is examined by comparing with controls such as Vibrio splendidus,Vibrio alginolyticus,Vibrio parahaemolyticus and Aeromonas hydrophila with the same condition.The control group can not cause obvious fluorescence alteration,while the experimental group results in significant fluorescence enhancement.Therefore,the sensor has good potential to expand its application to the early diagnosis determination of bacterium.

immuno-biosensor； Edwardsiella tarda(E.tarda)； graphene oxide(GO)； quantum dots(QDs)； FRET

2016—06—12

山東省科技發(fā)展計劃資助項目(2014GHY115024)

10.13873/J.1000—9787(2017)06—0038—04

TP 212.3

A

1000—9787(2017)06—0038—04

王淑嫻(1982-)，女，通訊作者，碩士，助理研究員，主要從事水產(chǎn)動物病害防治與檢測工作,E—mail:wangsx_2008@yeah.net。