抗人OX40單克隆抗體的制備和初步鑒定

侯小娟，陳鴻斌，袁旭東，王雙，仇瑋祎，孫志偉

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；2.北方戰(zhàn)區(qū) 空軍參謀部門診部，遼寧 沈陽 110015

抗人OX40單克隆抗體的制備和初步鑒定

侯小娟1，陳鴻斌1，袁旭東2，王雙1，仇瑋祎1，孫志偉1

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；2.北方戰(zhàn)區(qū) 空軍參謀部門診部，遼寧 沈陽 110015

目的：獲得全人源抗人OX40特異性抗體候選株，為相關(guān)藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。方法：依托本實驗室構(gòu)建的大容量全合成全人源噬菌體單鏈抗體庫平臺，以O(shè)X40為抗原進(jìn)行固相篩選，經(jīng)過3輪條件漸進(jìn)嚴(yán)苛的篩選后，陽性克隆得到富集；將其中富集效果最好的一株單鏈抗體scFv-1改造成全抗體（IgG1）形式，改造成功的重組質(zhì)粒按照一定比例轉(zhuǎn)染HEK293-F細(xì)胞進(jìn)行抗體的瞬時表達(dá)；基于AKTA系統(tǒng)對全抗體進(jìn)行純化，將純化得到的全抗體重命名為OX40mab-1。通過ELISA、間接免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)等試驗分別驗證OX40mab-1與抗原的結(jié)合活性、特異性、血清穩(wěn)定性；通過BIAcore 3000初步測定抗體親和力。結(jié)果：3輪篩選后得到1株富集率達(dá)95%的單鏈抗體，改造成全抗體形式后，與抗原OX40的結(jié)合EC50為0.015μmol/L；該抗體與其他無關(guān)抗原均不結(jié)合，特異性良好；37℃血清放置15 d后，與抗原依具有較好的結(jié)合活性，血清穩(wěn)定性良好；經(jīng)BIAcore 3000初步測定該抗體親和力為251 nmol/L。結(jié)論：獲得1株理化性質(zhì)良好、特異性較好的抗OX40全人源單克隆抗體OX40mab-1，具有繼續(xù)開發(fā)價值。

OX40；單克隆抗體；噬菌體抗體；特異性

靶向CTLA-4和PD-1的單克隆抗體在臨床研究中取得重大成功后，研究者開始嘗試以其他免疫檢查點為靶標(biāo)研發(fā)藥物，靶向T細(xì)胞表面分子治療性抗體的研發(fā)更是成為熱點。相比于T細(xì)胞表面?zhèn)鹘y(tǒng)的免疫檢查點CTLA-4、PD-1等共抑制分子來說，OX40屬于T細(xì)胞表面的共刺激分子，且廣泛表達(dá)于炎癥和腫瘤部位[1-2]的T細(xì)胞表面。OX40的激活能明顯促進(jìn)CD4+/CD8+T細(xì)胞的增殖、存活、分化及記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生和維持，并且能在活化的T、B細(xì)胞間進(jìn)行雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對OX40/OX40L通路進(jìn)行合理的激活或阻斷干預(yù)有可能達(dá)到治療相關(guān)疾病的效果。因此，以O(shè)X40為靶標(biāo)研發(fā)激活型或阻斷型抗體，對于腫瘤及自身免疫性疾病的治療都具有廣闊的應(yīng)用前景。

OX40（又稱CD134、TNFRSF4、ACT35）屬于腫瘤壞死因子受體超家族（TNFRSF），于1987年被發(fā)現(xiàn)[3]，是相對分子質(zhì)量約50×103的Ⅰ型跨膜糖蛋白，共含有277個氨基酸殘基（胞漿49個，胞外186個）[4]。OX40是一個相對保守的分子，其胞外段由3個完整的半胱氨酸富集區(qū)CRD1、CRD2、CRD3和1個不完整的半胱氨酸富集區(qū)CRD4組成，配體結(jié)合區(qū)主要位于CRD2、CRD3[5]，OX40/ OX40L通路的激活可以顯著促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和存活、相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生和維持[6-11]。其配體OX40L以三聚體的形式在抗原提呈細(xì)胞（APC）表面呈誘導(dǎo)性表達(dá)，在協(xié)助激活T細(xì)胞的同時還能促進(jìn)B細(xì)胞的活化及抗體的產(chǎn)生[12-13]，兩者能夠在活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞之間進(jìn)行雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

目前，在腫瘤免疫治療方面，至少有4種OX40激動劑進(jìn)入臨床研究階段，即MEDI6469、MEDI6383、MEDI0562和9B12，其適應(yīng)癥包括轉(zhuǎn)移性黑素瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌和頭頸癌等。9B12是鼠源IgG，已結(jié)束臨床Ⅰ期試驗；其余3個均是由Med Immune公司研發(fā)的人源化單抗，均在進(jìn)行臨床Ⅰ期試驗。AgonOx公司還研發(fā)了一種OX40L-ILZ-hFc重組融合蛋白，可以實現(xiàn)OX40L的三聚化，模擬體內(nèi)天然狀態(tài)下的受體配體結(jié)合模式。但是，迄今尚無全人源抗OX40激動型抗體進(jìn)入臨床研究階段。

本研究以O(shè)X40為靶標(biāo)，依托本實驗室構(gòu)建的全合成人源性噬菌體單鏈抗體庫固相篩選平臺，通過3輪條件逐漸嚴(yán)苛的固相篩選后，得到一株與抗原結(jié)合活性較好，特異性、血清穩(wěn)定性良好，親和力為251 nmol/L的全人源抗OX40候選單抗分子OX40mab-1，具有一定的開發(fā)潛力和應(yīng)用價值，可以進(jìn)一步進(jìn)行功能實驗驗證及其他相關(guān)實驗研究，為相關(guān)疾病的治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK293-F、A549細(xì)胞由本室保存；293T細(xì)胞株由陳惠鵬研究員實驗室惠贈；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-Blue、Top10購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；大容量全合成噬菌體單鏈抗體庫由本室構(gòu)建并保存；原始輔助噬菌體M13KO7購自Invitrogene公司并由本室保存；重組抗原OX40-his、表達(dá)載體pCMV3-OX40-GFP購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；OX40L-hFc購自上海近岸科技有限公司；檢測抗體anti-M13-HRP為GE公司產(chǎn)品；Goat-anti-human IgG-HRP、Goat-antimouse IgG-FITC購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Goat-anti-human IgG-PE購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；Prime star DNA聚合酶、T4DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、AflⅡ、NheⅠ、BsrGⅠ為NEB公司產(chǎn)品；其余常規(guī)耗材均購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院條件處；測序服務(wù)由本所提供。

PCR儀、CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀（Thermo）；顯微鏡（Nikon）；離心機(jī)（Sigma）；核酸電泳儀、分光光度計、蛋白電泳儀（Bio-Rad）；AKTA蛋白純化儀（Amersham Biosciences）；洗板機(jī)（BioTAK）；BIAcore 3000（GE Healthcare）；流式細(xì)胞儀（BD）。

1.2 抗原鑒定及抗OX40特異性抗體的篩選

PBS稀釋抗原溶液，分別加入還原（還原劑為β巰基乙醇）和非還原蛋白上樣緩沖液（5×），混勻，沸水煮5 min，離心，各取10μL樣品和蛋白marker上樣，電泳采用10%SDS-PAGE。

用PBS稀釋OX40至30μg/mL，1 mL/管，4℃過夜包被免疫管；次日，用2%牛血清白蛋白（BSA）于37℃封閉免疫管2 h，噬菌體抗體庫用封閉液（與免疫管封閉液相同，另加0.1%Tween-20）于37℃封閉30 min；4℃結(jié)合過夜；PBS、PBST洗滌數(shù)次；加入1 mL Glycine-HCl（pH2.2）洗脫；向洗脫液中加入對數(shù)生長期的大腸桿菌Trans1-Blue，37℃、150 r/min感染1 h；取1%感染后的菌液涂于2YT-CTG平板，37℃培養(yǎng)過夜，次日收集全部菌落；取適量菌液投入100 mL 2YT-CTG液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至D600nm為0.5時，按M13KO7∶Trans1-Blue=20∶1加入輔助噬菌體M13KO7，37℃、150 r/min感染 1 h，加入 0.15 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；次日，離心收取培養(yǎng)上清，加入1/5體積的PEG8000沉淀劑，沉淀噬菌體；沉淀重懸于PBS緩沖液中，取少量測定噬菌體滴度，其余凍存于-80℃?zhèn)溆谩５?、3輪篩選過程與第1輪篩選步驟基本一致，不同之處在于：①OX40包被濃度分別降低為10和1μg/mL；②洗滌強(qiáng)度提高；③OX40篩選封閉劑1%酪蛋白和2% BSA交替使用。

1.3 篩選后單克隆鑒定

挑取經(jīng)3輪篩選后的單克隆于96孔深孔板中，37℃搖床培養(yǎng)至D600nm為0.5，加入輔助噬菌體M13K07感染后，加入等體積2YT培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素，0.15 mmol/L IPTG），30℃搖床培養(yǎng)過夜，次日離心收取上清。PBS稀釋抗原至5 μg/mL，50μL/孔，4℃包被過夜。次日，加入5%脫脂奶粉，37℃封閉2 h；加入5%脫脂奶粉預(yù)封閉的單克隆噬菌體抗體上清，37℃靜置結(jié)合l h；PBST洗滌數(shù)次后加入HRP標(biāo)記的小鼠抗M13抗體，37℃靜置40 min；PBST洗滌數(shù)次；加入OPD顯色液，室溫靜置顯色；用2 mol/L H2SO4終止顯色；酶標(biāo)儀檢測D492nm值，630 nm作為參考波長。

1.4 陽性克隆的全抗體改造

對陽性單鏈抗體測序，分析測序結(jié)果并進(jìn)行全抗體改造，即將單鏈抗體輕、重鏈可變區(qū)基因克隆到人全抗體表達(dá)載體中。全抗體真核表達(dá)載體分別為pABG1（γ1重鏈）和pABL（λ輕鏈）。通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增單鏈抗體VH和VL基因，重鏈、輕鏈特異性擴(kuò)增正反向引物分別為H3F（5'-GCGCCCCTTAAGGGCGTGCAGTGCGAAGTGCAATTG GTGGAAAGC-3'，酶切位點是AflⅡ）、HR（5'-CG GTGCTAGCGCTCGACACGGTCACCAGAGT-3'，酶切位點是NheⅠ）和L3F（5'-CGCGTGTACAGGAA GCTGGGCCAGCTACGAACTGACCCAGCCGC-3'，酶切位點是BsrGⅠ）、LR（5'-CGCGAAGCTTGGTGC CACCGCCAAACACAT-3'，酶切位點是HindⅢ）；雙酶切后連接到人全抗體真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后送測序。

1.5 抗體在HEK293-F細(xì)胞中的瞬時表達(dá)及純化

將測序正確的全抗體輕重鏈質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10，37℃培養(yǎng)過夜；挑取單克隆37℃培養(yǎng)過夜，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑提取輕重鏈質(zhì)粒，并用分光光度計定量；吸取輕重鏈質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染試劑293fectin、Opti-MEM制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物并轉(zhuǎn)染HEK293-F細(xì)胞；培養(yǎng)4 d后離心收集培養(yǎng)上清，0.45μm濾膜過濾上清，用Protein A純化柱純化，純化后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.6 全抗體的結(jié)合活性鑒定

1.6.1 ELISA驗證OX40mab-1與重組融合蛋白OX40的結(jié)合活性 以O(shè)X40L為參照，ELISA驗證OX40mab-1與OX40在分子水平上的結(jié)合活性。稀釋抗原OX40至5μg/mL，4℃過夜包被酶聯(lián)板，加入稀釋好的OX40mab-1，終濃度從低到高依次為0.15、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/mL，每孔各做1個復(fù)孔；以Goat-anti-human IgG-HRP為二抗檢測全抗體與OX40的結(jié)合活性。

1.6.2 免疫熒光驗證OX40mab-1與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合活性 首先用表達(dá)載體pCMV3-OX40-GFP瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后顯微鏡下觀察OX40-GFP的表達(dá)情況，加入稀釋好的OX40mab-1，全抗體濃度為10μg/mL，以Goat-anti-human IgG-PE為二抗檢測OX40mab-1與細(xì)胞表面OX40的結(jié)合活性。

1.6.3 流式細(xì)胞術(shù)驗證OX40mab-1與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合活性和特異性 向轉(zhuǎn)染了pCMV3-OX40-GFP的 293T細(xì) 胞 中 加 入 稀 釋 好 的OX40mab-1，106細(xì)胞/樣品，OX40mab-1梯度稀釋到終濃度分別為0.4、0.08、0.016μg/mL，二抗為Mouse-anti-human IgG-APC，特異性對照細(xì)胞為293T（未轉(zhuǎn)染pCMV3-OX40-GFP）、Nalm6、A549，以平均熒光強(qiáng)度（MFI）表示OX40mab-1與細(xì)胞表面OX40的結(jié)合活性和特異性強(qiáng)度。

1.7 全抗體OX40mab-1的特異性鑒定

采用ELISA方法檢測抗體OX40mab-1的特異性。以O(shè)X40為抗原，EGFR、VEGF、CD47、PDL1、TNF、PLGF、TIM3為對照抗原，4℃過夜包被酶聯(lián)板，加入純化的OX40mab-1抗體，以Goat-anti-human IgG-HRP為二抗檢測全抗體的特異性。

1.8 全抗體的血清穩(wěn)定性研究

在超凈工作臺內(nèi)用0.22μm濾膜過濾高濃度抗體樣品，用無菌胎牛血清（未滅活）稀釋抗體樣品至100μg/mL，分裝，封口膜封口，置于濕盒內(nèi)，37℃溫箱放置，分別于第0、3、6、9、12、15 d取出樣品于-20℃凍存以備檢測。采用ELISA檢測，OX40mab-1稀釋濃度從低到高依次為0.75、1.5、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/mL，每孔做1個復(fù)孔，以第0 d（分裝后即-20℃凍存）樣品為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.9 全抗體的親和力測定

將抗原用緩沖液稀釋至1μg/mL，偶聯(lián)至預(yù)先包被有Prot-G的CM5芯片上；抗體OX40mab-1作為流動相，用HBS-EP緩沖液做1/2濃度梯度稀釋，濃度范圍為25～800μg/mL，進(jìn)行測試；完成一個反應(yīng)后，對芯片進(jìn)行再生；再生后繼續(xù)偶聯(lián)同樣目標(biāo)值的待檢測抗體，進(jìn)行下一輪反應(yīng)；實驗完畢，扣除空白對照和無關(guān)抗體對照響應(yīng)值，用BIA evaluation軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 抗原鑒定及全合成人源性噬菌體抗體庫的篩選

挑選適當(dāng)?shù)目乖抢檬删w抗體庫進(jìn)行固相篩選的關(guān)鍵步驟，抗原的質(zhì)量、純度均會對篩選造成巨大影響。

為獲得可用于篩選的抗原，通過SDS-PAGE鑒定抗原大小及純度，結(jié)果顯示購買所得的重組人OX40-his融合蛋白相對分子質(zhì)量約為45×103，符合理論值且純度較高（圖1），可用于篩選。

以O(shè)X40為抗原，對噬菌體單鏈抗體庫進(jìn)行3輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”固相篩選，特異性噬菌體抗體在篩選過程中得到富集。在篩選過程中，抗原包被量逐輪遞減，由第1輪的30μg/mL遞減到第3輪的1μg/mL。洗滌條件第l輪為PBST洗10次、PBS洗5次，第2輪為PBST洗15次、PBS（含0.2 mol/L NaCl）洗10次、PBS洗5次，在洗滌時間和力度上都有所增加，以進(jìn)一步增加篩選壓力。

采用ELISA對第3輪篩選獲得的單鏈抗體進(jìn)行鑒定，共挑取288個克隆，經(jīng)鑒定得到ELISA顯色值大于1.0的169株陽性克隆（圖2），這些陽性克隆在噬菌體水平上特異性結(jié)合OX40而與無關(guān)抗原（1%酪蛋白）不結(jié)合。測序結(jié)果顯示scFv-1的富集率高達(dá)95%，框架為λ3H3，其輕、重鏈CDR3區(qū)的序列分別為L-CDR3（AQDSDHVPW）和H-CDR3（HYIYSTSFDD）。

2.2 全抗體改造及表達(dá)、純化

圖1 OX40篩選前蛋白大小及純度鑒定

圖2 λ3H3噬菌體單鏈抗體庫第3輪篩選所獲克隆ELISA檢測結(jié)果

本室構(gòu)建的噬菌體抗體庫是單鏈抗體庫，抗體以單鏈抗體的形式展示在噬菌體表面，因此需要將單鏈抗體改造為全抗體（IgG1）的形式，以進(jìn)一步對抗體進(jìn)行鑒定。PCR擴(kuò)增輕重鏈可變區(qū)得到600～700 bp的片段（圖3），再通過酶切、連接克隆到人全抗真核表達(dá)載體中，測序表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確；轉(zhuǎn)染HEK293-F細(xì)胞，表達(dá)上清經(jīng)Protein A柱純化，純化后樣品經(jīng)SDS-PAGE證實獲得了OX40mab-1全抗體樣品（圖4）。

2.3 全抗體結(jié)合活性鑒定

2.3.1 ELISA驗證OX40mab-1與重組融合蛋白OX40-his在分子水平上的結(jié)合活性 為驗證所得抗體與抗原在分子水平上的結(jié)合活性，以O(shè)X40L-hFc融合蛋白為對照，以二者的結(jié)合曲線表示OX40mab-1、OX40L-hFc與OX40的結(jié)合活性，并進(jìn)行比較，結(jié)果如圖5，兩者與OX40的結(jié)合活性基本相當(dāng)，并沒有數(shù)量級上的差異，其EC50分別為0.015、0.024μmol/L。

圖3 單鏈抗體輕重鏈可變區(qū)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果

圖4 OX40mab-1純化后的SDS-PAGE鑒定

圖5 OX40mab-1與抗原OX40結(jié)合的ELISA鑒定結(jié)果

2.3.2 間接免疫熒光驗證OX40mab-1與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合活性 為檢測所得抗體與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合活性，用OX40表達(dá)載體pCMV3-OX40-GFP瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以GFP熒光為指示，獲得OX40+293T細(xì)胞，進(jìn)行間接免疫熒光試驗，結(jié)果如圖6，瞬時轉(zhuǎn)染的pCMV3-OX40-GFP在293T表面表達(dá)良好，且OX40mab-1、OX40L-hFc均與293T表面的OX40有良好結(jié)合，huIgG組和空白對照組細(xì)胞熒光強(qiáng)度極弱，幾乎檢測不到。

2.3.3 流式細(xì)胞術(shù)驗證OX40mab-1與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合活性和特異性 為驗證所得抗體與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合活性和特異性，首先對轉(zhuǎn)染pCMV-OX40-GFP的293T細(xì)胞進(jìn)行流式檢測，結(jié)果如圖7，轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞表面OX40表達(dá)量明顯提高，且分2群，一群OX40高表達(dá)，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)；另一群低表達(dá)，熒光強(qiáng)度較弱。

OX40mab-1與轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞表面OX40的結(jié)合活性較強(qiáng)，當(dāng)OX40mab-1抗體濃度為0.4μg/ mL時檢測到的平均熒光強(qiáng)度最高，且平均熒光強(qiáng)度隨抗體濃度的下降而減弱，說明OX40mab-1抗體濃度與結(jié)合的平均熒光強(qiáng)度具有劑量關(guān)系，空白對照和huIgG組熒光強(qiáng)度極弱（圖8）。

以293T（未轉(zhuǎn)染）、Nalm6和A549為對照細(xì)胞檢測，OX40mab-1的特異性較好，與這幾種細(xì)胞均不結(jié)合（圖9）。

2.4 全抗體的特異性鑒定

圖6 OX40mab-1與293T-OX40GFP結(jié)合的免疫熒光鑒定

為驗證OX40mab-1的特異性，采用ELISA檢測全抗體與OX40的特異性結(jié)合，對照抗原包括EGFR、VEGF、CD47、PDL1、TNF、PLGF、TIM3。結(jié)果顯示純化后的OX40mab-1與OX40結(jié)合特異性良好（圖10），只特異性結(jié)合OX40抗原，與其他對照抗原基本不結(jié)合。

2.5 全抗體血清穩(wěn)定性鑒定

為驗證OX40mab-1的血清穩(wěn)定性，用50%無菌胎牛血清（未滅活）稀釋OX40mab-1并于37℃溫箱放置，分別于第0、3、6、9、12、15 d取出樣品于-20℃凍存以備檢測。ELISA結(jié)果顯示經(jīng)過15 d的37℃血清放置后，該抗體與抗原依然具有較好的結(jié)合活性，證明該抗體具有良好的血清穩(wěn)定性（圖11）。

2.6 全抗體親和力測定

圖7 pCMV3-OX40-GFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞流式檢測結(jié)果

圖8 OX40mab-1與293T-OX40GFP細(xì)胞結(jié)合的流式檢測

圖9 OX40mab-1與293T、Nalm6、A549細(xì)胞結(jié)合特異性流式檢測

圖10 OX40mab-1與抗原結(jié)合特異性的ELISA檢測

圖11 OX40mab-1血清穩(wěn)定性的ELISA檢測

為檢測OX40mab-1與OX40的親和力，采用BIAcore 3000測定抗體與重組OX40抗原結(jié)合的親和力，用BIA evaluation軟件分析結(jié)果。結(jié)果顯示OX40mab-1具有較高的結(jié)合速率（Ka=2.6×105mol/L），但其解離速率也較高（Kd=65 mmol/L），因此親和力為251 nmol/L（圖12）。

圖12 BIAcore 3000測定OX40mab-1的親和力

3 討論

我們經(jīng)過3輪條件逐漸嚴(yán)苛的噬菌體抗體庫篩選后得到1株富集良好的克隆，即OX40mab-1，改造成全人抗體形式并順利表達(dá)純化。經(jīng)驗證，該抗體與重組蛋白OX40及細(xì)胞表面抗原OX40的結(jié)合活性良好；與無關(guān)抗原、細(xì)胞表面其他蛋白和不表達(dá)OX40的對照細(xì)胞均不結(jié)合，特異性良好；37℃血清放置15 d后該抗體與抗原OX40仍有較好的結(jié)合，證明其血清穩(wěn)定性良好；BIAcore 3000測得該抗體的親和力為251 nmol/L，已相當(dāng)接近于天然狀態(tài)的OX40/OX40L單體親和力150 nmol/L。相比于鼠單抗和人源化單抗，全人源抗體具有更低的免疫原性和更長的半衰期。

由于靶向T細(xì)胞表面的激動型抗體是一個探索較少同時研究難度較大的領(lǐng)域，機(jī)遇和風(fēng)險并存。OX40的激活能夠明顯促進(jìn)CD4+/CD8+T細(xì)胞的增殖、存活、分化及記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生和維持，進(jìn)而提高T細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答，這使得OX40成為潛在的良好的抗腫瘤免疫刺激靶標(biāo)。若能獲得T細(xì)胞激活功能良好的全人源抗OX40激動型抗體，將具有廣闊的腫瘤治療前景。但由于激動型抗體對于抗原抗體的結(jié)合表位和抗體結(jié)構(gòu)要求較高，又由于OX40/OX40L的三聚體結(jié)合模式，使得高親和力、結(jié)構(gòu)正確且功能活性良好的抗體極難獲得，從而使全人源抗OX40激動型抗體的研發(fā)具有較大的挑戰(zhàn)性。

但同時，因OX40/OX40L通路能夠在活化的T細(xì)胞和APC之間提供雙向轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，使OX40L在協(xié)同OX40刺激T細(xì)胞存活的同時又能促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生高效價的抗體及抗體的類別轉(zhuǎn)換，因此在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎等自身免疫疾病及移植物抗宿主病患者中，通過OX40抑制性抗體阻斷OX40/OX40L通路，可以下調(diào)免疫系統(tǒng)對自身抗原的免疫應(yīng)答，平衡機(jī)體內(nèi)Th1、Th2類細(xì)胞因子的含量。目前已有一株全人源抗OX40阻斷型抗體進(jìn)入臨床Ⅱ期研究階段。因此，即使不能獲得激動型的抗OX40抗體，篩選中獲得的阻斷型抗體也可以考慮用于針對自身免疫病的候選藥物研發(fā)。

與配體相近的親和力以及全人源單抗的高安全性是該抗OX40單抗候選分子的優(yōu)勢，但其發(fā)揮功能活性的類型仍須進(jìn)一步驗證。我們的后續(xù)研究將會著眼于對該抗體進(jìn)行親和力成熟和生物學(xué)活性鑒定，確定其激活性或抑制性生物學(xué)活性，從而明確本研究獲得的OX40mab-1是否可作為腫瘤或自身免疫病治療的候選分子，為進(jìn)一步藥物開發(fā)提供依據(jù)。

[1]Vetto J T,Lum S,Morris A,et al.Presence of the T-cell activation marker OX-40 on tumor infiltrating lymphocytes and draining lymph node cells from patients with melanoma and head and neck cancers[J]. Am J Surg,1997,174(3):258-265.

[2]Durkop H,Latza U,Himmelreich P,et al.Expression of the human OX40(hOX40)antigen in normal and neoplastic tissues[J].Br J Haematol,1995,91(4):927-931.

[3]Paterson D J,Jefferies W A,Green J R,et al.Antigens of activated rat T lymphocytes including a molecule of 50,000 Mr detected only on CD4 positive T blasts[J].Mol Immunol,1987,24(12):1281-1290.

[4]Mallett S,Fossum S,Barclay A N.Characterization of the MRC OX40 antigen of activated CD4 positive T lymphocytes--a molecule related to nerve growth factor receptor[J].EMBO J,1990,9(4):1063-1068.

[5]Compaan D M,Hymowitz S G.The crystal structure of the costimulatory OX40-OX40L complex[J].Structure,2006,14(8):1321-1330.

[6]Rogers P R,Song J,Gramaglia I,et al.OX40 promotes Bcl-xL and Bcl-2 expression and is essential for long-term survival of CD4 T cells[J].Immunity, 2001,15(3):445-455.

[7]Gramaglia I,Weinberg A D,Lemon M,et al.Ox-40 ligand:a potent costimulatory molecule for sustaining primary CD4 T cell responses[J].J Immunol,1998, 161(12):6510-6517.

[8]Ohshima Y,Yang L P,Uchiyama T,et al.OX40 costimulation enhances interleukin-4(IL-4)expression at priming and promotes the differentiation of naive human CD4+T cells into high IL-4-producing effectors [J].Blood,1998,92(9):3338-3345.

[9]Ruby C E,Montler R,Zheng R,et al.IL-12 is required for anti-OX40-mediated CD4 T cell survival [J].J Immunol,2008,180(4):2140-2148.

[10]Lathrop S K,Huddleston C A,Dullforce P A,et al. A signal through OX40(CD134)allows anergic,autoreactive T cells to acquire effector cell functions[J].J Immunol,2004,172(11):6735-4673.

[11]Ruby C E,Redmond W L,Haley D,et al.Anti-OX40 stimulation in vivo enhances CD8+memory T cell survival and significantly increases recall responses [J].Eur J Immunol,2007,37(1):157-166.

[12]Flynn S,Toellner K M,Raykundalia C,et al.CD4 T cell cytokine differentiation:the B cell activation molecule,OX40 ligand,instructs CD4 T cells to express interleukin 4 and upregulates expression of the chemokine receptor,Blr-1[J].J Exp Med,1998,188(2):297-304.

[13]Ohshima Y,Tanaka Y,Tozawa H,et al.Expression and function of OX40 ligand on human dendritic cells [J].J Immunol,1997,159(8):3838-3848.

Preparation and Preliminary Identification of Human Anti-OX 40 M onoclonal Antibody

HOU Xiao-Juan1,CHEN Hong-Bin1,YUAN Xu-Dong2, WANG Shuang1,QIU Wei-Yi1*,SUN Zhi-Wei1*
1.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071;
2.Out-Patient Department of Air Force Staff in Northern Theater Command,Shenyang 110015;China

Objective:To harvest a fully human anti-human OX40 specific antibody for developing related drug.Methods:We chose OX40 as a target antigen to screen specific antibodies from the fully human single-chain antibody phage library and got the enriched positive clones after 3 rounds of solid screening.The best enriched single-chain antibody scFv-1 was redesigned to be a fully human antibody,and the corresponding recombinant plasmid was transfected into HEK293-F cells for transient expression.The final prodcut,named as OX40mab-1,was purified based on AKTA system,and the binding activity,specificity,serum stability were verified via ELISA,indirect immunofluorescence,and flow cytometry respectively．The affinity of OX40mab-1 was determined via BIAcore 3000．Results:After 3 rounds of screening,a single chain antibody with an enrichment rate of 95%was harvested,and was reconstructed into a fully human antibody OX40mab-1 The binding EC50of OX40mab-1 to OX40 was 0.015μmol/L.OX40mab-1 did not bind to unrelated antigens,showing its specificity,and its good binding activity to antigen retained after 15 days in serum at 37℃,proving its serum stability and its affinity was 251 nmol/L determined by BIAcore 3000．Conclusion:An anti-OX40 fully human monoclonal antibody with good binding activity,specificity,and serum stability was obtained,and deserves for further development．

OX40;monoclonal antibody;phage displayed antibody;specificity

R392.1

A

1009-0002（2017）03-0242-07

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.003

2017-03-10

侯小娟（1991-），女，碩士研究生，（E-mail）13051578182@163.com

仇瑋祎，（E-mail）qiuweiyi831@163.com；孫志偉，（E-mail）szwyhhh@aliyun.com

*Co-corresponding authors,QIU Wei-Yi,E-mail:qiuweiyi831@163.com;SUN Zhi-Wei,E-mail:szwyhhh@aliyun.com