低溫對6份柱花草種質生長的影響及抗冷性評價

陳志堅 彭璽如 羅佳佳 劉攀道 李欣勇 丁西朋 郇恒福 劉國道

摘 要 分析了低溫（6 ℃）處理對6份柱花草種質地上部鮮重、相對電導率、丙二醛（MDA）含量、葉綠素濃度和最大光化學效率（Fv/Fm）的影響，并比較不同柱花草種質抗冷性的差異。結果表明：低溫處理降低了柱花草的地上部鮮重、葉綠素濃度和Fv/Fm值，增加了柱花草葉片相對電導率和丙二醛含量，但是，低溫處理對不同種質的影響有所差異。在6份柱花草種質中，種質TF41抗冷能力最強，其他5份種質（TF29、TF57、TF220、TF303和TF2001）抗冷能力較弱。研究結果為柱花草抗冷機理研究及抗冷柱花草品種改良提供了理論依據和種質材料。

關鍵詞 柱花草；低溫脅迫；抗冷性評價

中圖分類號 S541 文獻標識碼 A

Abstract Shoot fresh weight， relative electric leakage， malondialdehyde（MDA）content， chlorophyll concentration and maximum photochemical efficiency（Fv/Fm）of six Stylosanthes（stylo）accessions were investigated under chilling stress（6 ℃）. Results showed that the six tested stylo accessions exhibited different responses to chilling stress. The shoots fresh weight， chlorophyll concentration and Fv/Fm of stylo accessions differentially decreased by chilling treatment， while relative electric leakage and MDA content in the leaves of stylo increased under chilling stress. Comprehensive evaluation analysis with subordinate function showed that among the six tested stylo accessions， TF41 exhibited the superior ability of chilling resistance. Taken together， our results not only provide a theoretical basis for dissecting the mechanisms underlying stylo resistant to chilling， but also provide germplasm resources for improving stylo varieties to chilling stress.

Key words Stylosanthes； chilling stress； chilling resistance evaluation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.010

自然界中，低溫脅迫是限制植物生長和發育的重要因素之一。低溫容易造成植物機體損傷，導致產量降低，甚至植株死亡[1-2]。低溫影響植物對礦質營養的吸收，影響呼吸作用和新陳代謝等生理過程[3]。研究表明，低溫處理降低植物葉綠素含量、最大光化學效率（Fv/Fm）和光合速率[4]。低溫脅迫會產生超氧陰離子（O2-）、羥自由基（·OH）和過氧化氫（H2O2）等活性氧物質（ROS，reactive oxygen species），ROS的積累會造成膜脂過氧化，增加丙二醛（MDA）含量，破壞細胞結構和功能[5-6]。在長期進化過程中，植物形成了一系列適應低溫脅迫的機制，如通過調控抗氧化系統抵抗氧化傷害，增強感受低溫信號途徑相關基因的表達提高耐低溫能力[7-9]。此外，在低溫脅迫下，植物體內積累的滲透調節物質，如可溶性蛋白、游離脯氨酸以及可溶性糖含量等，在植物耐低溫中發揮著重要作用[10]。

柱花草（Stylosanthes spp.）是重要的熱帶豆科牧草，可用于牧草飼料、果園覆蓋、綠肥作物以及天然草地改良等。柱花草具有耐貧瘠和酸性土壤、草品質好等特點，已成為熱帶和亞熱帶地區廣泛種植及應用的豆科牧草。20世紀60年代至今，柱花草已在我國南方各省（區）推廣種植，累積種植面積已超過20萬hm2[11]。然而，柱花草對低溫脅迫較為敏感，10 ℃以下的低溫就會導致柱花草葉片失綠變黃，甚至引起植株死亡，嚴重影響了推廣和應用，因此，低溫脅迫問題已成為柱花草實際生產和應用中的重要難題[12-14]。

目前，對柱花草響應低溫脅迫的機理已有相關的研究報道。低溫脅迫顯著抑制柱花草的生長，但通過添加外源脫落酸（ABA），能夠提高柱花草抗氧化能力、維持較高的最大光化學效率和保護光系統II，從而增強柱花草耐低溫能力[15]。并且，研究發現，信號分子NO和Ca2+也參與了ABA提高柱花草抗冷能力的過程中[16-17]。此外，外源水楊酸（SA）和NO供體硝普鈉（SNP）處理，也能夠提高柱花草抗氧化酶活性，降低葉片相對電導率及MDA含量，從而減輕低溫脅迫對柱花草幼苗的傷害[18]。但篩選與培育抗冷柱花草品種是應對低溫環境的根本途徑，對南方大力發展草牧業具有重要的實際意義。然而，迄今為止，對不同柱花草種質抗冷性評價分析較少，并且，采用的實驗方法及評價體系不同，結論不盡相同[19-20]。因此，本研究以6份柱花草種質為材料，分析低溫（6 ℃）處理對柱花草生長、相對電導率、MDA含量、葉綠素濃度和Fv/Fm的影響，并運用隸屬函數法綜合比較不同柱花草種質抗冷性的差異，以期為探索柱花草抗冷機理及抗冷柱花草品種改良提供理論依據及種質材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗共用到6份柱花草種質，編號分別為TF29（Stylosanthes guianensis）、TF41（Stylosanthes grandifolia）、TF57（Stylosanthes hamata）、TF220（Stylosanthes guianensis）、TF303（Stylosanthes guianensis）和TF2001（Stylosanthes guianensis）。柱花草種子來自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所草業研究室。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法 柱花草種子處理萌發后，播種于盆栽營養基質中（為滅菌土、腐殖土和蛭石按2 ∶ 1 ∶ 1比例的混合物），并于中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所草業研究室溫室培養。柱花草幼苗正常培養40 d后，移至人工氣候培養箱中進行低溫處理。實驗設置2個處理溫度，分別為28 ℃（對照）和6 ℃（低溫）。低溫處理7 d后，柱花草幼苗轉移到28 ℃下恢復生長3 d。分別于低溫處理7 d和恢復生長3 d收獲柱花草地上部樣品，測定各項生理指標。每個處理設置3個生物學重復。

1.2.2 測定項目 收獲地上部樣品并稱取鮮重。質膜透性用電導法測定。丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸法[6]。葉綠素含量測定采用分光光度法[21]。葉片最大光化學效率（Fv/Fm）采用Pocket PEA熒光儀（Hansatech，英國）測定。每個指標測定設置3個生物學重復。

1.3 數據統計分析

采用Microsoft Excel 2003作圖，通過SPSS20.0（SPSS Institute，美國）軟件進行單因素方差分析。測定指標增加率或降低率=（冷處理下測定值-CK測定值）/CK測定值×100%。當冷處理下各性狀測定值>CK各性狀測定值，則為增加率；當冷處理下各性狀測定值2 結果與分析

2.1 低溫處理對柱花草生長的影響

如圖1所示，6 ℃低溫處理7 d顯著抑制柱花草的生長，但不同種質受低溫處理影響的程度不一樣，其中，種質TF41在低溫處理下的表型性狀與對照條件下相似，表明其受低溫影響較低。低溫處理顯著抑制了6份柱花草種質的地上部鮮重，相對對照處理，TF57、TF303、TF2001、TF29、TF220和TF41在低溫處理下的地上部鮮重分別降低了31.9%、45.4%、38.7%、46.4%、25.8%和16.6%（圖2-A）。并且，柱花草經低溫處理后，恢復生長3 d，TF41的地上部鮮重相對對照處理下，降低了18.7%，而其他種質地上部鮮重降低了22.2%～63.6%（圖2-B）。以上結果表明，在6份柱花草種質中，TF41具有較強的耐低溫能力。

2.2 低溫處理對柱花草葉片質膜透性的影響

低溫處理顯著增加了柱花草葉片相對電導率及丙二醛含量（圖3）。相對對照處理，TF57、TF303、TF2001、TF29、TF220和TF41在低溫處理下的葉片相對電導率分別增加了70.2%、84.4%、84.7%、83.6%、53.7%和39.3%，丙二醛含量分別增加了62.9%、68.7%、60.8%、67.1%、55.9%和44.6%，（圖3-A、B）。恢復生長3 d后，相對對照處理，TF57、TF303、TF2001、TF29和TF220的葉片相對電導率增加了44.1%～82.4%，而TF41僅增加了18.9%，TF57、TF303、TF2001、TF29和TF220的丙二醛含量增加了48.3%～66.4%，而TF41僅增加了29.9%（圖3）。以上結果說明TF41葉片質膜透性受低溫處理影響低于其他種質。

2.3 低溫處理對柱花草葉綠素濃度及最大光化學效率（Fv/Fm）的影響

從圖4-A可以看出，低溫處理對柱花草葉綠素濃度影響不大，只顯著降低了TF2001和TF220葉片葉綠素濃度（分別降低了17.2%和18.5%），但是，恢復生長3 d后，相對對照處理，TF57、TF303、TF2001、TF29和TF220的葉綠素濃度降低了49.1%～82.9%，而TF41僅降低了21.8%（圖4-A）。低溫處理顯著抑制了6份柱花草種質的Fv/Fm值，TF57、TF303、TF2001、TF29、TF220和TF41在低溫處理下的Fv/Fm分別比對照處理降低了36.9%，40.4%，50.0%，38.3%，42.1%和17.2%，而恢復生長3 d后，Fv/Fm分別比對照處理降低了62.7%，72.3%，66.9%，56.7%，45.3%和26.5%（圖4-B）。以上結果表明，在低溫處理下，相對其他種質，TF41能夠維持較高的葉綠素濃度及最大光化學效率。

2.4 柱花草種質抗冷性綜合評價

本研究進一步對低溫處理下，地上部鮮重、相對電導率、丙二醛含量、葉綠素濃度和Fv/Fm等5個指標的變化進行分析，計算隸屬函數值，綜合評價柱花草的抗冷能力。結果表明，種質TF41綜合評價D值最大，為1.000，TF220和TF57次之（分別為0.589 7和0.415 5），TF303、TF29和TF2001最小，為0.141 9～0.230 4（表1）。因此，TF41抗冷能力最強，為抗冷型柱花草，TF220、TF57、TF303、TF29和TF2001為冷敏感型柱花草。并且，從表1可以看出，地上部鮮重、電導率、丙二醛和Fv/Fm與隸屬函數值顯著負相關，表明以上4個指標可作為柱花草抗冷能力評價和鑒定的參考指標。

2.5 柱花草種質抗冷性聚類分析

對地上部鮮重、相對電導率、丙二醛含量、葉綠素含量及Fv/Fm等5個指標數據結果進行標準化處理，采用歐氏距離，利用離差平方和法，對6份種質材料進行聚類分析。結果表明柱花草種質在歐氏距離為3.63處可以分為2個類群（圖5）。第1類群只有種質TF41，各項指標受低溫處理影響較小，認為是抗冷型柱花草；第2類群包括種質TF220、TF57、TF2001、TF303和TF29，各項指標顯著受到低溫處理的影響，屬于冷敏感型柱花草（圖5）。

3 討論

低溫脅迫是限制植物生長和發育的非生物脅迫之一。低溫條件下柱花草生長明顯受到抑制，嚴重的低溫脅迫會導致柱花草植株死亡[14]。本研究發現，6份柱花草種質在受到低溫脅迫時，會導致地上部鮮重降低，這與Lu等[6]和Bao等[14]在柱花草中的研究結果相似，低溫處理顯著抑制柱花草的生長。在低溫條件下，種質TF41能夠維持較高的生物量，表明其具有較強的耐低溫能力。在低溫脅迫下，維持較低的相對電導率和MDA含量，說明細胞膜受到膜脂過氧化程度較低，抗寒性強[5-6]。在本研究中，6份柱花草種質受到低溫脅迫后，相對電導率和MDA含量顯著增加，冷害造成膜脂過氧化。這與柱花草、黃瓜、核桃和越橘的研究結果相似，寒害造成膜脂過氧化，導致相對電導率和MDA含量增加[6，23-24]。并且，在低溫處理和恢復生長條件下，種質TF41的相對電導率和MDA含量增加率最小，表明TF41葉片質膜受低溫處理的影響低于其他種質。

低溫脅迫直接影響葉綠體中酶的活性，從而影響葉綠素的合成，并且，葉綠素熒光參數中最大光化學效率可有效的反映PSⅡ受到低溫傷害的程度[4]。本研究發現，低溫處理顯著抑制了6份柱花草種質的Fv/Fm值，但相對其他種質，TF41能夠維持較高的葉綠素濃度及Fv/Fm，表明TF41抗冷能力高于其他種質。類似的，低溫處理顯著降低了柱花草“熱研4號”葉綠素濃度、Fv/Fm和光合速率，進而抑制了光合作用[4]。在對玉米耐寒性分析中也有類似報道[25]，可見低溫脅迫對葉綠素含量和Fv/Fm有重要影響。

植物抗寒是一個復雜的生理生化過程，受到多種因素的影響，單一指標作為抗寒指標的直接評價難以全面反映植物的真實抗寒情況，需要以多個指標為依據進行綜合評價植物的抗寒性[19，22]。因此，本研究運用隸屬函數法，綜合比較不同柱花草種質抗冷性的差異。結果表明，TF41抗冷能力最強，為抗冷型柱花草，其余5份種質為冷敏感型柱花草。并且，聚類分析結果表明6份柱花草種質的抗冷性可以分為2個類群，第1類群只有種質TF41，第2類群包括其余5份種質，與抗冷性綜合評價結果一致，進一步說明種質TF41具有較強的抗冷能力。

綜上所述，在6份柱花草種質中，種質TF41抗冷能力最強，為抗冷型柱花草。研究結果發現地上部生物量、電導率、丙二醛含量和Fv/Fm等4個指標可作為柱花草抗冷能力評價和鑒定的參考指標。本研究為柱花草種質的創新利用及抗冷柱花草品種改良提供了理論依據及新的種質材料，并且，種質TF41可作為柱花草抗冷機理研究的重要材料，其抗冷機理值得做進一步的分析。

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