橡膠樹花青素合成調控因子HbAn的克隆及其功能分析

黃天帶 方永軍 暢姣 陳濤 辛士超 Naychi Koko 黃華孫 華玉偉

摘 要 橡膠樹轉基因過程篩選效率低阻礙了轉基因研究快速發展。花青素累積產生的紫紅色肉眼直接可辨，是一種簡單、安全的可視化篩選標記。為利用橡膠樹花青素作為轉基因篩選標記，本文首先以R2R3-MYB保守結構域（R2、R3）為探針調取橡膠樹R2R3-MYB，并與擬南芥等其他物種花青素合成相關的R2R3-MYB進行進化分析，結果顯示橡膠樹scaffold0374_923317和Scaffold0598_393375與其他物種已功能驗證的花青素合成調控R2R3-MYB聚到同一亞類。隨后從古銅期葉片中克隆到scaffold0374_923317基因，并將其命名為HbAn1。序列分析表明，HbAn1蛋白具有R2R3-MYB蛋白的典型結構：R2R3結構域及bHLH互作結構域。定量表達分析表明HbAn1在古銅期葉片及暗培養莖稈中高水平表達，在其他時期葉片及光照培養莖稈中表達水平很低，與不同組織花青素含量正相關。最后，在煙草中組成型過表達HbAn1，使煙草葉片、花瓣、花托、花絲等組織大量累積花青素，定量分析表明其激活了這些組織后期花青素合成酶基因NtDFR， NtLDOX， NtUFGT。本文首次獲得橡膠樹花青素累積相關的正調控因子R2R3-MYB（HbAn1），這為花青素作為橡膠樹轉基因可視化篩選標記提供了基因資源。

關鍵詞 橡膠樹；花青素；可視化篩選標記；R2R3-MYB；結構域

中圖分類號 S432.1 文獻標識碼 A

Abstract The low screening efficiency for the positive embryo of rubber trees hinders the development of transgenic research in Hevea. Red purple from anthocyanin， which can be detected by naked eyes， is a simple and safe visual marker. In order to take anthocyanin as the selective marker to improve the screening efficiency for the positive embryo of rubber trees， R2R3-MYB of rubber trees was cloned based on the conserved domain of R2R3-MYB， and the phylogenetic relationship with the anthocyanin-related R2R3-MYB of Arabidopsis thaliana and other species was analyzed， Results showed that scaffold 0374_923317 and Scaffold 0598_393375 were classified in the same sub-group with other known anthocyanin-related R2R3-MYB regulators. Then scaffold0374_923317 isolated from the bronze leaf， and named as HbAn1， had the typical conserved R2R3 and bHLH interaction domain. Quantitative expression analysis revealed that the expression of HbAn1 decreased gradually with the development of rubber leaves， which was coincided with the anthocyanin accumulation contents of rubber leaves. The expression of HbAn1 was also coincided with green and red stems， indicating that the expression of HbAn1 was positively correlated with rubber tree anthocyanin accumulation. Finally， in constitutive overexpression HbAn1 tobacco， the anthocyanin accumulation increased extremely in tobacco leaves， petals， filaments and receptacles caused by activating the late flavonoid pathway genes NtDFR， NtLDOX， NtUFGT. In this paper， for the first time， R2R3-MYB positively regulating anthocyanin accumulation in H. brasiliensis was isolated， which would provide a gene resource for the visual selection marker of H. brasiliensis transformation.

Key words Hevea brasiliensis； anthocyanin； visual selection marker； R2R3-MYB； domain

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.015

1994年，馬來西亞的Arokiaraj等[1]使用基因槍法轉化橡膠樹花藥愈傷組織，在世界上首次獲得2株橡膠樹轉基因植株。隨后，Jayashree等[2]、Leclercq等[3]、Sunderasan等[4]通過根癌農桿菌介導法分別將功能基因橡膠樹超氧化物歧化酶基因（HbSOD）、銅鋅超氧化物歧化酶基因（HbCuZnSOD）和人心鈉素基因（HANF）導入橡膠樹。我國黃天帶等[5]通過農桿菌介導花藥愈傷組織獲得11株轉基因橡膠樹，隨后，Huang等[6]以次生胚為侵染受體，轉化效率提高到4.06%。

然而，到目前為止，橡膠樹均以nptII為篩選標記，gus或gfp為報告基因，篩選效率低、準確性差。以50 mg/L卡那霉素作為選擇壓，抗性胚狀體GUS陽性率僅為1.9%[6]；以100 mg/L巴龍霉素作為選擇壓，抗性愈傷GUS陽性率僅為17.9%[7]；將卡那霉素濃度提高到300 mg/L，抗性愈傷GUS陽性率也僅為4%[2]。Leclercq等[8]試圖利用gfp在早期篩選出陽性愈傷組織，提高篩選效率，然而，24塊GFP陽性愈傷團經過7次繼代增殖及巴龍霉素篩選后，累計為7 510個愈傷團，最終僅篩選出12個陽性愈傷系（0.2%），因此，由于GFP檢測需要依賴特殊儀器，且熒光淬滅快，未能提高篩選效率及準確率。而GUS需要添加昂貴底物，且為破壞性檢測，不能實現活體實時監測。

花青素是一種肉眼直接可辨、簡單、安全的篩選標記，通常呈紅色或紫紅色，作為可視化篩選標記，已成功應用于玉米、煙草、西紅柿、蘋果、葡萄轉基因研究[9-13]及病毒侵染示蹤[14]、硼元素缺乏實時監測[15]，無需專用設備或化學試劑，對材料無破壞性。

橡膠樹古銅期葉片以及暗培養的幼嫩植株莖稈均為紫紅色，同時，橡膠樹胚狀體受茉莉酸誘導時從白色變為紫紅色，這些組織的顏色均由花青素——矢車菊素累積造成[16-18]。植物花青素合成主要由R2R3-MYB、bHLH和WD40三類轉錄因子構成MBW（MYB-bHLH-WD40）復合體調控[19-20]，其中R2R3-MYB直接激活結構基因的表達[21-22]，是調控花青素合成的關鍵因子，其具有2個高度保守的、可結合DNA的MYB結構域（R2、R3結構域），且R3結構域內通常含有一個與bHLH互作的[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R基序[23]。

本研究利用植物花青素合成R2R3-MYB調控基因功能和結構保守性，首先通過生物信息學調取橡膠樹花青素合成相關的R2R3-MYB，隨后，克隆了橡膠樹花青素合成相關的R2R3-MYB（HbAn1），并通過組織定量表達分析和煙草過表達證明其正調控花青素合成，為利用花青素作為橡膠樹遺傳轉化可視化篩選標記提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

巴西橡膠樹熱研7-33-97古銅期、淡綠期、變色期、穩定期等4個發育時期的葉片以及黑暗和光照培養下幼苗嫩莖，作為橡膠樹花青素合成調控基因克隆及其表達分析的研究材料。

1.2 方法

1.2.1 利用生物信息學篩選橡膠樹花青素合成R2R3-MYB蛋白 以R2R3-MYB保守結構域（R2、R3）為探針，從橡膠樹基因組數據庫中調取R2R3-MYB轉錄因子，隨后，從NCBI中調取擬南芥等植物已驗證功能的控制花青素合成的R2R3-MYB，利用clustal omega（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進行蛋白系統進化分析，篩選與已驗證功能的花青素合成調控基因在同一進化分支的橡膠樹R2R3-MYB。

1.2.2 克隆與橡膠樹花青素合成調控相關R2R3-MYB蛋白基因 依據系統進化分析結果，調取與已驗證功能的其他物種花青素合成調控基因在同一進化分支的橡膠樹R2R3-MYB蛋白的cDNA序列，設計特異擴增引物（正向引物：5′ GGCTAGCTTCA

TCATATATGGAAGGC，反向引物：GGTGGTGTAA

AGCTTAAAACATCTCATCG），以古銅期葉片cDNA為模板，用Takara的Primer STAR MAX進行PCR擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，用OMEGA公司的Gel Extraction kit（100）凝膠回收試劑盒進行目的片段回收測序。

1.2.3 HbAn1在橡膠樹不同花青素含量組織表達分析 以古銅期、變色期、淡綠期和穩定期等4個發育時期葉片、暗培養和光培養體胚植株嫩莖cDNA為模板，Premix Ex Taq為反應酶，熒光定量PCR反應在Light Cycler @2.0熒光定量PCR儀中進行（Roche公司）。熒光定量引物見表1。反應程序為95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min。反應體系為10 μL，其中5 μL 2×Premix Ex Taq，0.25 μL引物（10 μmoL），0.5 μL cDNA模板。反應結果使用Light Cycler Software 4.05軟件進行分析。以RH8作為內參基因，標準品cDNA和待測樣品均設置3次重復。

1.2.4 HbAn1在煙草中過表達分析 將HbAn1克隆到pCAMBIA2301中，以CaMv35S作為啟動子，Nos作為終止子，然后，轉化到GV3101中用于侵染煙草，侵染方法及培養基參照Pattanaik等[24]。待紫紅色抗性芽長至2 cm左右大小時，剪下，轉入篩選生根培養基中，誘導其生根，生根后再移栽到溫室。

以轉基因煙草葉片、花瓣等組織的cDNA為模板，通過熒光定量PCR，對煙草花青素合成調控基因NtAn1（bHLH）和NtAn2（MYB）及結構基因進行表達分析，確定橡膠樹轉錄因子的表達對煙草花青素合成基因調控作用，除了退火溫度外，反應條件及反應體系與1.2.3相同，以煙草NtTub基因為內參。引物序列見表1。

1.3 數據分析

熒光定量結果采用2-ΔΔCT方法分析，用SAS軟件（V9.0）進行顯著性分析，α=0.05。

2 結果與分析

2.1 控制橡膠樹花青素合成R2R3-MYB生物信息學分析結果

對橡膠樹全基因組掃描R2R3-MYB，共獲得177個R2R3-MYB，然后，從NCBI下載擬南芥AtPAP2（AT1G66390.1）、矮牽牛PhAN2（AB982128.1）、煙草NtAN2（FJ472647.1）、金魚草AmROSEA1（DQ275529.1）、金魚草AmROSEA2（DQ275530.1）、金魚草AmVENOSA（DQ275531.1）、蘋果MdMYB10（DQ267896.1）、馬鈴薯StAN1（AY841127.1）、葡萄VvMYBA1（AB097923.1）、葡萄VvMYBA2（AB097924.1）等10個花青素合成相關R2R3-MYB，進化分析發現，橡膠樹scaffold0374_

923317和Scaffold0598_393375與已鑒定的花青素合成相關轉錄調控因子在同一進化分支（圖1），推測兩者與橡膠樹花青素合成調控可能相關，后續分析以兩者為目標基因展開。

2.2 與橡膠樹花青素合成調控相關R2R3-MYB克隆及結構域分析結果

從橡膠樹基因組數據庫中調取scaffold0374_

923317和Scaffold0598_393375序列，并以此序列為檢索序列，對作者單位葉片轉錄組數據進行檢索，調取其基因序列，隨后，設計特異擴增PCR引物進行擴增，結果獲得與scaffold0374_923317相同的基因序列，測序后其全長為618 bp（圖2），將其命名為HbAn1。Scaffold0598_393375未擴增到，推測可能該Scaffold為拼接序列。

與擬南芥AtPAP2（AT1G66390.1）、矮牽牛PhAN2（AB982128.1）、煙草NtAN2（FJ472647.1）、金魚草AmROSEA1（DQ275529.1）、金魚草AmROSEA2（DQ275530.1）、金魚草AmVENOSA（DQ275531.1）、蘋果MdMYB10（DQ267896.1）、馬鈴薯StAn1（AY841127.1）、葡萄VvMYBA1（AB097923.1）、葡萄VvMYBA2（AB097924.1）等10個花青素合成相關R2R3-MYB蛋白序列比對發現，HbAn1蛋白不但具有R2R3-MYB兩個保守結構域，同時，在R3結構域中具有與bHLH互作結構域（D/E）LX2（R-K）X3LX6LX3R，此結構域是花青素合成MYB調控因子的特征結構域，預示著HbAn1可能是調控橡膠樹花青素合成關鍵調控因子。

2.3 HbAn1在不同花青素含量組織中表達分析結果

以古銅期、變色期、淡綠期和穩定期等4個時期葉片及暗培養和光照培養嫩莖為材料，進行HbAn1熒光定量PCR分析發現，HbAn1隨著葉片老化及花青素逐漸褪去，其表達量逐漸下降，同時，暗培養嫩莖中HbAn1表達要高于光照培養嫩莖（圖3），這與花青素含量正相關，預示著HbAn1與橡膠樹花青素累積可能具有相關性。

2.4 HbAn1在煙草中過表達分析結果

通過農桿菌介導的煙草葉片轉化，共獲得11個轉化植株，本研究挑取3個轉化植株進行了后續研究。在發育早期，葉片花青素累積隨著植株長大，花青素逐漸褪去，如在植株分化階段以及生根早期，葉片累積大量花青素，而隨著植株葉片增多，新抽出的葉片花青素累積量變少（圖4-A～C）。在植株長大后，其葉片、花瓣、花托、花絲均較非轉基因的植株大量累積花青素（圖4-D～F），但是，葉片累積花青素明顯低于花瓣、花托和花絲。

為了檢測HbAn1過表達對煙草內源結構基因表達影響，對葉片、花瓣、花托和花絲等4個組織表達分析發現，在這4個組織中內源花青素合成結構基因均上調表達，尤其是3個后期結構基因NtDFR、NtANS和NtUFGT表達量極顯著上調（圖5）。對于內源花青素合成調控因子，在不同組織中表達模式與結構基因有所不同，在花瓣中NtAn1（bHLH）和NtAn2（MYB） 有所下調，在花托和花絲中NtAn1和NtAn2或NtAn2被上調，然而，在葉片中NtAn1和NtAn2并沒有發生顯著改變（圖6）。

3 討論

3.1 獲得橡膠樹花青素合成R2R3-MYB基因HbAn1，為橡膠樹遺傳轉化可視化篩選標記提供候選基因

以往研究發現R2R3-MYB蛋白異源表達后，受體物種不累積花青素或累積組織存在差異[25，29]，主要原因如下：（1）外源調控因子與受體物種調控因子不能互作[25]；（2）無法識別、激活受體花青素結構基因啟動子[22]；（3）轉錄因子的表達具有組織特異性[26-27]；（4）受體物種/組織沒有花青素合成調控因子或/和結構基因[28]。但植物自身的花青素合成調控基因能激活自身花青素累積[12，26，29]。綜上所述，利用外源MYB基因轉化橡膠樹其表型難以預期，而物種自身轉錄因子過表達則能有效提高該物種花青素累積量，因此需要克隆橡膠樹自身MYB基因。據我們所知，橡膠樹中未見花青素合成相關R2R3-MYB基因克隆報道。

本文獲得了1個R2R3-MYB基因，其具有R2R3-MYB蛋白的典型特征：含R2、R3保守結構域，且R3結構域具有與bHLH蛋白互作結構域（圖2），其表達模式與橡膠樹花青素累積正相關（圖3），其通過與煙草內源花青素合成調控因子互作（圖5）且/或促進煙草花青素合成結構基因尤其是后期基因表達量提高（圖6）正調控煙草花青素合成（圖4），以上證據表明本研究克隆到了橡膠樹正調控花青素合成R2R3-MYB基因，我們將其命名為HbAn1，為橡膠樹遺傳轉化可視化篩選標記提供候選基因。

3.2 HbAn1可以作為煙草轉基因可視化篩選標記

由于其高再生能力，煙草常作為植物基因功能驗證的模式植物，為了在大量的非轉化細胞中篩選出陽性轉化子，通常通過抗生素加gus基因的方式。篩選步驟繁瑣、準確率低。

花青素肉眼可見，將其作為遺傳轉化報告基因可實現實時活體監測，但是其過量表達影響植物生長甚至致死[13]，是其作為可視化篩選標記的最大障礙。過表達HbAn1煙草，新生小苗葉片為紫紅色（圖4-A、B），隨著植株長大，抽出的新葉為正常綠色（圖4-C）。植株進入生殖生長后，其花器官（花瓣、花絲、花托）大量累積花青素（圖5-B、C），但是不影響轉基因植株正常結實，種子正常萌發（數據未提供）。由此可見，HbAn1可通過紫紅色葉片在煙草轉基因早期篩選出陽性芽，并可在花器官形成時進一步確認轉化事件，而不影響轉基因植株的營養生長、結實及種子萌發。因此，HbAn1在煙草中的表達模式使其可直接作為煙草轉化的可視化篩選標記。

3.3 HbAn1作為橡膠樹轉基因可視化篩選標記

橡膠樹遺傳轉化以nptII作為篩選標記，以gus和gfp作為報告基因[2-8]，或假陽性率高，或需要添加昂貴底物且破壞受檢材料，或需要特殊儀器且受本底熒光干擾。因此需要開發無需添加底物、對材料無破壞性、無需特殊設備的新型可視化篩選標記以實現精準篩選。

本研究克隆了橡膠樹花青素合成R2R3-MYB正調控因子HbAn1，其能否作為可視化篩選標記基因應用于橡膠樹遺傳轉化研究的關鍵是受檢組織是否存在花青素合成途徑。橡膠樹遺傳轉化均依賴體胚再生體系，抗性胚是重要的篩選對象[2-6，8]。前期研究表明橡膠樹胚狀體存在花青素合成的完整途徑，且能被茉莉酸調控[17-18]，因此可進一步推斷過表達HbAn1可激活胚狀體花青素合成結構基因表達，從而促進胚狀體累積花青素，使胚狀體從白色變成紫紅色，實現肉眼識別轉化子。

花青素作為遺傳轉化篩選標記的最大問題是其過量表達影響植株再生及生長[13]。因此，篩選表達量適宜的組織特異型啟動子使花青素僅在子葉累積，從而實現活體篩選但不影響植株正常生長發育，是花青素能否作為可視化篩選標記應用于橡膠樹轉基因研究需要解決的問題。

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