響應面優化藍藥睡蓮總酚水提工藝的研究

臧濤 向東

摘 要 以藍藥睡蓮為材料，采用響應面分析法對睡蓮花總酚的水提工藝條件進行研究。在單因素試驗基礎上，選取提取溫度、液料比、提取時間為試驗因素，利用中心復合試驗設計原則進行響應面優化試驗，確定最佳提取工藝。結果表明，藍藥睡蓮總酚水提的最佳工藝條件為：提取溫度74 ℃、液料比 43 ∶ 1 mL/g、提取時間51 min，在此條件下所得總酚提取率為11.5%，與預測值基本相符合，為睡蓮花的進一步研究提供了理論依據。

關鍵詞 藍藥睡蓮；水提；總酚；響應面法

中圖分類號 O625.31；Q949.746.1 文獻標識碼 A

Abstract The water extraction of total polyphenols from N. stellata Willd was studied by Response Surface Methodology（RSM）. On the basis of single factor experiments， the extraction temperature， liquid to material ratio and extraction time were selected as the experimental factors. The response surface optimization experiment was carried out using the principle of a central composite design. Results showed that the optimum extraction conditions were extracting temperature 74 ℃， liquid-material ratio 43 ∶ 1 mL/g， extracting time 51 min， and the total phenol extraction rate under this condition was 11.5%. The experimental predictions are basically consistent. The study would provide a theoretical basis for further study of lotus.

Key words Nymphaea stellata Willd； water extraction； total phenol； response surface methodology

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.025

藍藥睡蓮（Nymphaea stellata Willd.）屬于睡蓮科睡蓮屬，是一種生長在湖泊和河流岸邊的多年生水生熱帶草本植物，又被稱之為星形睡蓮、藍睡蓮或延藥睡蓮[1]。其原產于印度和東南亞，在中國主要分布在海南、廣東及云南等地[2]。藍藥睡蓮作為尼泊爾、印度以及中國西藏的傳統藥物，具有廣泛的藥用價值，不僅具有抗菌、消炎、麻醉、止血、利尿等作用，還可以用于心悸、消化不良、腸炎、腹瀉、感冒等治療[3]。現研究已表明，藍藥睡蓮中含有豐富的酚類成分，如槲皮素、山奈酚、沒食子酸及它們的衍生物等[4]，具有抗氧化、抗炎、抑菌、降血糖、降血脂、預防心血管疾病等多種生物活性[5-8]。

目前，藍藥睡蓮產品的開發利用較少，主要應用于鮮切花的觀賞和裝飾品，鮮切花保存期短，不易貯藏，浪費較嚴重。中國花茶飲用歷史悠久，隨著人們生活水平的提高，人們對健康和高品味生活的追求日益增加，藍藥睡蓮作為藥食兩用的資源，不僅可以作為花茶飲用，還可以制備成茶飲料等多種產品，減少了資源浪費，具有廣泛的開發利用價值。傳統的總酚提取工藝多采用有機溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等進行提取[9]，容易導致有機溶劑的殘留，不利于藍藥睡蓮做為藥食兩用資源在食品、醫藥中的應用。水提法不僅具有方便、簡單、快速、易于實現工業化等優點[10]，而且減少了有機溶劑的使用，具有更加實用的價值和意義。現已有學者對茶葉[11]、光皮木瓜[12]、肉桂[13]等酚類物質水提工藝進行了研究，關于藍藥睡蓮總酚水提工藝的研究目前尚未見報道。因此，本試驗采用響應面法對藍藥睡蓮中酚類物質的水提工藝條件進行優化，得到最佳提取工藝，為進一步深入開發利用睡蓮花提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

藍藥睡蓮：采自海南省海口市紅旗鎮。

試劑：Folin-酚（北京索萊寶科技有限公司）；沒食子酸（標準品，純度≥98%，上海英偉生物科技公司）；無水碳酸鈉（分析純，廣州化學試劑有限公司）。

儀器：HH-ZK4電恒溫水浴鍋（鞏義予華儀器有限公司）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TS-RO-20L/H超純水設備（陶氏水處理設備工程有限公司）；SP-722可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 材料預處理 選取色澤新鮮已開放的藍藥睡蓮花，去掉最外層帶有綠色的花瓣，切掉花柄，底部花托僅留3～5 mm，將其在60 ℃烘箱中烘干，將花瓣粉碎過80目篩后備用。

1.2.2 沒食子酸標準曲線的制作[14] 準確稱取沒食子酸100 mg，用超純水溶解并定容至100 mL。分別制得濃度為0.100、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL的沒食子酸標準溶液；取各濃度標準溶液0.1 mL，加入20 mg/mL 的Na2CO3溶液2 mL。2 min后，加入0.9 mL Folin-酚試劑，反應30 min，用分光光度計測定各組溶液在750 nm處的吸光度，以吸光度為縱坐標，沒食子酸濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.3 睡蓮干花中酚類物質的提取及測定 準確稱取粉碎后的睡蓮干花花瓣，按一定液料比加入蒸餾水，在設定的溫度下水浴浸提一定時間后，將浸提液進行抽濾，將濾液移入100 mL容量瓶中，定容，用量程為0.2 mL的移液槍精確量取0.1 mL于10 mL刻度試管中，按1.2.2的方法進行操作，測定其吸光度，根據標準曲線，計算出提取液中總酚的提取率。以不加提取液的空白處理作參比。

1.2.4 單因素試驗 以睡蓮花總酚的提取率為考察指標，對液料比、提取時間、提取溫度進行單因素試驗，考察這3個因素對睡蓮花中總酚提取效果的影響。

提取溫度對睡蓮花總酚提取效果的影響：當液料比為30 ∶ 1 mL/g時，分別在40、50、60、70、80、90 ℃下水浴提取40 min后，按1.2.2的方法測定吸光度，計算總酚提取率。

液料比對睡蓮干花總酚提取效果的影響：當液料比分別為20 ∶ 1、30 ∶ 1、40 ∶ 1、50 ∶ 1、60 ∶ 1、70 ∶ 1 mL/g時，分別在70 ℃下水浴提取40 min后，按1.2.2的方法測定吸光度，計算總酚提取率。

提取時間對睡蓮花總酚提取效果的影響：當液料比為30 ∶ 1 mL/g，溫度為70 ℃時，分別水浴提取10、20、30、40、50、60、70 min后，按1.2.2的方法測定吸光度，計算總酚提取率。

1.2.5 響應面優化試驗設計 在單因素試驗的基礎上，利用Design Expert 8.05b軟件，采用中心復合試驗設計原則建立數學模型[15]，以睡蓮花中總酚的提取率為響應值，對液料比、提取時間、提取溫度這3個因素進行響應面試驗，優化出最佳提取工藝條件。因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

如圖1所示，得回歸方程為y=1.317 5x+0.011 2，其相關系數為R2=0.998 4，回歸分析表明，在0～1.0 mg/mL濃度范圍內睡蓮花中酚類物質的質量濃度與吸光度呈良好線性關系，可用于定量分析。因此，利用回歸方程，根據吸光度，可計算總酚的提取率。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取溫度對總酚提取效果的影響 由圖2可知，隨著提取溫度的增加，總酚的提取率增大，提取液中總酚含量存在差異顯著，原因可能是隨著溫度的增加，酚類物質的溶出率增加，提取率增加，當溫度達70 ℃時，睡蓮花總酚提取率最高，繼續升高溫度，總酚提取率稍有下降，這是因為溫度升高，部分酚類物質結構可能受高溫破壞或被氧化，導致提取率下降。當溫度在80～90 ℃之間，差異不顯著。因此，在響應面試驗時選擇60～80 ℃為適宜的提取溫度。

2.2.2 液料比對總酚提取效果的影響 由圖3可知，液料比對睡蓮干花花瓣總酚提取率有顯著影響，提取液的總酚含量在不同的液料比中存在顯著差異，隨著液料比的增加，睡蓮花總酚的提取率呈先上升后下降的趨勢，當液料比為40 ∶ 1 mL/g時，總酚提取率達最高，這是由于前期液料比較低，酚類物質沒有完全溶出，隨著液料比的增加，溶出的酚類物質達到最大，繼續增加一方面可能由于溶劑增多，其提取液濃度被稀釋了，導致提取率下降，另一方面可能是溶劑增大，使其他一些可溶性的雜質溶解的量也逐漸增大，使得多酚提取含量下降[16]。因此，在響應面試驗時選擇液料比為30 ∶ 1～50 ∶ 1 mL/g為宜。

2.2.3 提取時間對總酚提取效果的影響 由圖4可以看出，提取時間對睡蓮花總酚提取率具有一定的影響。隨著提取時間的增加，睡蓮花總酚提取率隨提取時間延長而增加，在20～60 min，提取液中總酚含量存在差異顯著，當時間為50 min時達到最大；繼續延長提取時間，總酚提取率下降，這可能是因為多酚物質較不穩定，隨著提取時間的延長導致酚類物質發生氧化分解，從而導致酚類物質提取率下降[17]。在提取時間為60～70 min時，總酚含量差異不顯著，因此，在響應面試時選擇40～60 min為適宜的提取時間。

2.3 響應面分析

2.3.1 模型的建立與顯著性檢驗 根據單因素試驗結果，選取提取溫度、液料比、提取時間為影響因素，采用中心復合試驗設計原則，進行響應面優化試驗，試驗方案和結果見表2。利用Design Expert 8.05b軟件對試驗數據進行回歸分析，得到模型對應的二次多項回歸方程為：Y=11.36+0.33A+0.34B+0.088C+0.1AB-0.16AC+0.063BC-0.42A2-0.77B2-0.25C2

為進一步驗證模型的可靠性，對回歸方程進行方差分析，結果見表3。該模型p<0.000 1，為差異極顯著，說明該模型回歸方程的自變量和因變量的線性關系顯著；失擬項p=0.087 9>0.05，不顯著，且R=0.989 3，R2Adj=0.979 6，說明該二次回歸模型是適當的，模型與實際擬合情況好，誤差較小，實驗方法可靠。因此，可以利用該模型較好的分析和預測在不同條件下睡蓮花中總酚的提取情況。由表3可知，影響因素A提取溫度和B液料比對響應值有極顯著影響（p<0.01），影響因素C提取時間對響應值有顯著影響（p<0.05），此外，AC即提取溫度與提取時間之間的交互作用差異為極顯著（p<0.01），AB即提取溫度與液料比之間的交互作用差異為顯著（p<0.05），顯著表中各因素的F值可以反映因素對響應值的重要性，F值越大，表明對響應值的影響越大，重要性越大[18]，分析可知，各因素對睡蓮花總酚提取率的影響程度大小順序為：液料比（B）>提取溫度（A）>提取時間（C）。

2.3.2 響應曲面的分析與條件優化 響應曲面圖和等高線圖可以形象的反映響應值隨各因素的變化趨勢[19]。因此，采用Design Expert 8.05b軟件對試驗結果進行處理，繪制了提取溫度、液料比、提取時間這3個因素之間的交互作用對總酚提取率影響的響應曲面圖和等高線圖，見圖5～7，可以看出液料比的響應曲線陡峭，隨著液料比的增大，提取率上升較明顯，說明液料比對總酚提取率的影響較大，另外，等高線的形狀可以反映兩因素之間的交互作用，等高線形狀為橢圓形時說明兩因素之間的交互作用顯著，為圓形時說明交互作用不顯著[20]。圖6等高線圖形狀為橢圓形，說明AC之間存在顯著的交互作用，圖7等高線圖形狀近似于圓形，說明BC之間的交互作用不顯著，這與上述方差分析結果相符合。

利用Design Expert 8.05b軟件對總酚提取率的工藝進行優化得到最佳工藝條件為：提取溫度74.08 ℃、液料比42.51 mL/g、提取時間50.81 min，預測總酚提取率理論值為11.47%，在此優化條件下，根據實際可操作情況，將工藝調整為：提取溫度74 ℃、液料比43 ∶ 1 mL/g、提取時間51 min，經3次試驗得到的睡蓮花總酚提取率平均值為11.5%，與理論值接近，說明此模型可行。

3 討論

目前，關于植物多酚提取工藝的研究報道較多，但對藍藥睡蓮總酚提取工藝的研究尚未見報道。藍藥睡蓮中富含有多種酚類物質，景贊等[14]對藍藥睡蓮中多酚類物質抗氧化活性和降糖作用進行了研究，發現藍藥睡蓮中酚類物質含量較高，具有明顯的抗氧化活性和降糖作用，可廣泛應用于功能性食品、醫藥等行業，而藍藥睡蓮在實際作為食品和藥品的應用中多采用水進行浸提，因此有必要對其水提工藝條件進行研究。

響應面分析法是一種利用合理的實驗設計方法，采用多元二次回歸方程來擬合因素和響應值之間的函數關系，并通過回歸方程來尋找最佳響應值的統計方法[16]。該法與傳統的正交設計相比，不僅能了解在提取過程中不同因素之間的交互作用程度，而且能更加精確的確定提取工藝的最佳點，對于非線性影響因素的預測指導性更強，具有更好的應用價值[21]。因此，本試驗在單因素的基礎上，選擇對酚類物質含量影響較大的因素，通過響應面分析法對睡蓮花總酚提取率的水提工藝條件進行優化，利用Design Expert 8.05b軟件，根據中心復合試驗設計原則進行試驗，建立了合理可靠的數學模型，得到了因素的主效應關系為：液料比>提取溫度>提取時間，最后確定最佳的工藝參數為：提取溫度74 ℃、液料比43 ∶ 1 mL/g、提取時間51 min。該工藝安全、經濟又實用，為睡蓮花茶飲料等產品的開發，以及深入研究睡蓮花提供了一定的參考價值和理論依據。

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